1、第十一章 基因工程菌与固定化细胞,第一节 基因工程菌的构建与培养,一、工程菌简介,1、生产药物,表（续）,表（续）,2、生产限制性内切酶,已商品化400多种,EcoRI GAATTC EcoRV GATATC BamHI GGATCC BglII AGATCT BstI GGATCC HindII AAGCTT HpaI GTTAAC KpnI GGTACC MboI GATC,3、生产生物小分子, 合成Vc,双（多）菌发酵 单菌发酵, 合成靛蓝 蓼兰叶提 化学合成 重组大肠杆菌生产, 生产氨基酸, 合成新的抗生素,4、生产生物多聚体,足丝粘性蛋白 蓝贻贝 强度特别高、防水 生物合成橡胶 蔗糖
2、 17酶反应 可降解塑料 PHA、PHB,二、工具酶、载体与宿主,一）基因工程工具酶,1、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）, 能识别双链DNA分子的特定序列，并在识别位点或其附近切割DNA的一类内切酶,在细菌细胞内限制性酶与DNA甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，利用限制酶降解进入细胞内的外源DNA，同时用甲基化酶修饰细菌本身DNA，以避免被酶降解。, 识别序列通常由48个碱基对组成，具有二重旋转对称轴，序列呈回文结构（palindromic structure）,Hind III的识别序列：,5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5
3、,5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5,粘性末端（cohesive end）,HpaI的识别序列：,5 - G T T A A C - 3 3 - C A A T T G - 5,5 - G T T A A C - 3 3 - C A A T T G - 5,平末端（blunt end）,2、DNA连接酶（DNA ligase）,T4 DNA连接酶大肠杆菌DNA连接酶,在体外将目的基因和载体共价连接构成重组DNA分子,3、其它,DNA聚合酶：从大肠杆菌中提取，用于体外合成DNA,碱性磷酸脂酶：用于DNA连接时对载体的某段末端进行修饰，以减少载体的自身环化,核酸外切酶：
4、用于DNA的缺失分析,单链核酸内切酶：用于修饰粘性末端及进行DNA结构分析,二）克隆载体,以扩增外源DNA为目的载体-克隆载体（cloning vector）,作为克隆载体的基本条件：,1）载体在细胞中必须能够进行独立自主地复制,2）载体应具有若干限制酶的单一切割位点，便于外源DNA的插入,3）载体必须具有可供选择的遗传标记,4）载体DNA须易于生长和操作,基因工程的常用载体：,质粒载体 噬菌体载体 柯斯质粒载体 M13噬菌体载体 噬菌粒载体 真核细胞的克隆载体 人工染色体,1、质粒克隆载体,a）低分子量有利于DNA的分离和操作；b）具有较高拷贝数；c）易于导入细胞；d）具有安全性；,特点：,
5、质粒载体克隆外源DNA片段的大小一般不超过15Kb,2、噬菌体克隆载体,将野生型噬菌体DNA进行改造后建成，主要是去掉噬菌体 DNA上过多的常用限制酶的酶切位点，及对非必要基因区域 进行改造。,特点：,1）它的分子遗传学背景十分清楚,2）噬菌体载体的容量较大。一般质粒载体只能容纳10多个kb。而噬菌体载体却能容纳大约23kb的外源DNA片段。,3）具有较高的感染效率。其感染宿主细胞的效率几乎可达100，而质粒DNA的转化率却只有0.1。,4）和质粒相比，噬菌体具更为狭窄的寄主范围，更加安全,与溶原性相关的基因可以被外源DNA取代而不影响噬菌体的感染、复制和裂解宿主细胞的能力。,经过体外基因操作
6、和包装后形成重组噬菌体，可以通过正常的感染途径进入宿主细胞；重组噬菌体DNA也可不经过体外包装而直接通过转染（转化）方式进入宿主细胞.,质粒和噬菌体载体都可用于 构建基因文库；但后者更有优势：容纳的外源DNA片段较大；以感染途径进入宿主细胞的 效率比转化高；,3、柯斯质粒载体,柯斯质粒载体 （cosmid vector）， 又称粘粒，是由 噬菌体的粘性末端 和质粒构建而成。,Cosmid (cos site-carrying plasmid) 带有粘性末端位点( cos) 的质粒,特点：,1）具有噬菌体的特性,在克隆了外源片段后可在体外被包装成噬菌体颗粒，高效地感染对噬菌体敏感的大肠杆菌细胞。
7、进入寄主的柯斯质粒DNA分子，按照噬菌体DNA的方式环化，但无法按噬菌体的方式生活，更无法形成子代噬菌体颗粒。,2）具有质粒载体的特性,在寄主细胞内如质粒一样进行复制，携带有抗性基因和克隆位点，并具氯霉素扩增效应。,3）具有高容量的克隆能力,柯斯质粒本身一般只有57kb左右，而它克隆外源DNA片段的极限值竟高达45kb，远远超过质粒载体及噬菌体载体的克隆能力。同时，由于包装限制，柯斯质粒载体的克隆能力还存在一个最低极限值。例如， 5 kb大小的柯斯质粒载体，插入的外源片段至少不能小于30 kb。,柯斯质粒用于克隆大片段的DNA分子特别有效，而这种特性对于研究高等生物的基因组十分重要。,4、M1
8、3噬菌体载体,M13是大肠杆菌丝状噬菌体，其基因组为环状ssDNA，大小为6407bp,生活史：,1）通过性毛感染雄性（F+或Hfr）大肠杆菌; 或通过转染进入雌性大肠杆菌细胞.,2）进入细胞后，转变成复制型 (RF) dsDNA，然后以滚环方式复制出ssDNA。每当复制出单位长度正链，即被切出和环化，并被立即组装成子代噬菌体和以出芽方式（即宿主细胞不被裂解）被释放至胞外。, M13克隆载体是对野生型M13进行改造后建成，其特点是虽然克隆外源DNA的能力较小，一般只适于克隆300400bp的外源DNA片段，但特别适合用于制备克隆基因的单链DNA。, 主要被用于制备测序用单链DNA模板、特异的单
9、链DNA探针，进行定位诱变等，也可用于噬菌体展示（phage display）。,5、噬菌粒载体,丝状噬菌体和质粒载体DNA融合而成，兼有两者优点。,噬菌粒载体,6、真核生物的克隆载体,真核生物基因调控以及真核基因产物转录及翻译后的加工等问题，单用原核生物载体所很难解决,常用的真核生物载体：,1）酵母质粒载体2）真核生物病毒载体,7、人工染色体,酵母人工染色体（yeast artificial chromosome, YAC）,细菌人工染色体（bacteria artificial chromosome, BAC）,人工染色体的最大特点是克隆外源DNA能力非常大，例如一个YAC可插入长达100
10、0 kb以上DNA片段，BAC的外源DNA插入量为300 kb，特别适合于对结构复杂的高等生物的基因组进行分析。,三）基因工程的宿主,1、宿主的基本要求与性质, 能够高效吸收外源DNA；, 具有使外源DNA进行高效复制的酶系统；, 不具有限制修饰系统；, 不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-）；, 便于进行基因操作、筛选和大量繁殖；, 具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害或无致病性等。,2、常用的基因工程宿主,1）大肠杆菌 2）枯草芽孢杆菌 3）酿酒酵母,特点：生长迅速、极易培养、能在廉价培养基中生长，遗传学及分子生物学背景十分清楚,三、工程菌构建过程简介,复制子,目的基因
11、,选择性基因,启动子,受 体 菌,1）目的基因的获得2）载体的选择与准备3）目的基因与载体连接成重组DNA 4)重组体的选择,1、目的基因的获得,基因文库（gene library）法,cDNA 文库法,PCR法,2、DNA 的连接,粘端 平端 接头,3、重组体导入受体细胞,转化 电转化 转导,4、重组体的选择,酶切分析 -互补 菌落原位杂交,四、质粒的不稳定性及其控制, 在工程菌工业化生产研究中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。, 带有质粒的细胞生长较慢；生长速率的降低与所带质粒的大小成正比。,一） 质粒不稳定的类型,1、分离性不稳定：由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导
12、致整个质粒丢失。,2、结构性不稳定由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。,缺失有3种情况：,C）缺失可能发生在质粒复制的起始区这种情况会导致整个质粒丢失,B）缺失发生在质粒的选择性标记区域e.g. pVC102(amy+ NmR CmR ) amy NmR CmS 如果重组质粒只有单一的选择性标记，这种情况会被误认为质粒丢失,A）缺失发生在质粒复制起始区及选择性标记以外往往使工程菌仍带有选择性标记但不能正常表现目的基因的表型,二）影响质粒稳定的因素,工程菌的稳定与否，取决于重组质粒本身的分子组成、宿主细胞生理和遗传性及环境条件3个方面,1、与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身
13、对其稳定性的影响,例如：质粒pSC101的Hind II片段有复制功能，并证明该片段上还含有与质粒稳定性有关的序列 （00.27kb间； 被称为分配定子 par ）,Par座位的功能类似于真核细胞染色体上的着丝点，在细胞分裂时促进质粒分配，从而使质粒能稳定地传给子代细胞。,质粒pAcyc18 4在无选择压力下培养100代时丢失质粒的细胞占32%；而由pAcyc184构建的含par座位片段的质粒pPM31在同样条件下未测得有丢失质粒的细胞,Par座位可使与其无关的par-质粒稳定传代。 如将par座位插入到pBR322-trp上可使其质粒稳定性提高3-30倍。,2、宿主对质粒稳定的影响, 宿主种
14、类 相对而言，重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。枯草杆菌细胞内基因重组频率较高，是使质粒不稳定的一个原因, 遗传背景一般选用rec,E.coliDH5 F- endA1 hsdR17(rk-mk-) supE44 thi-1recA1(argF-lacZYA)U16980dlacZM15-,S17-1 E.coli294(F-thi pro hsdR) recA derivative,3、质粒拷贝数, 质粒拷贝数受所用的受体菌株生理和生长条件的强烈影响,质粒拷贝数影响质粒的稳定性，高拷贝系统比低拷贝系统更稳定, 重组蛋白质产生的数量随重组质粒拷贝数的增加而增加, 但高
15、拷贝质粒会导致重组菌比生长速率减少，这样轻微的 质粒分离性不稳定会导致重组细胞被无质粒细胞迅速取代,4、重组质粒的表达对质粒稳定性的影响, Singl研究质粒丢失和表达之间的关系，所用的质粒编码色氨酸合成酶组分A, 即trpA。 trpA基因表达为敏感PL启动子所控制；, 外源基因表达水平愈高，重组质粒往往越不稳定；如果基因表达得到控制，则重组质粒可能不会丢失。, 启动子的去抑制会引起无质粒细胞的迅速增加。,C. Parker等研究了含酸性磷酸酯酶 (AP) 基因的2 重组质粒的表达对其稳定性的影响 发现：, AP基因的表达由培养时有机磷与无机磷的比例来控制。, 有机磷含量越高，AP基因表达越
16、强，质粒越不稳定；当培养基中只供给无机磷酸盐时，AP基因不表达，而质粒此时也最稳定。, 质粒表达使其稳定性受影响的原因可能是在质粒基因转录时影响了质粒的复制及分配，同时也影响了质粒的修复，这些因素使得质粒容易发生结构上的变化或丢失。, 另外，外源基因与染色体基因表达利用共同的起始因子、酶、核糖体、代谢能量及生物合成前体，这种竞争会导致重组菌的比生长速率低于无质粒细胞的比生长速率。,三）使质粒稳定的措施,在培养环境中高温（如42以上）、去垢剂（如SDS)、某些药物（如利福平）、染料（如丫啶类）、饥饿、紫外线辐射等都会引起质粒的丢失，因此常需采取一些措施以防止或降低工程菌的不稳定性。,1、组建合适
17、载体, 常用质粒pBR322和pUB110在相应的宿主中很稳定，如二者组成穿梭质粒或与外源片段进行重组后，常出现不稳定现象。, pC194是枯草杆菌中的一个常用质粒，亦较稳定，但在其HindIII切口处插入一段DNA，形成的重组质粒的稳定性就差了。在无选择压力的情况下经20世代后，含pC194的菌体占总菌体的 99.5%以上，而重组质粒则有10%80%被丢失。,改造、构建能稳定表达的质粒载体是构建工程菌的重要一环。针对不同的载体及不同的目的采取不同的策略,2、选择适当宿主, 重组质粒的稳定性在很大程度上受宿主细胞遗传特性的影响, 同一种宿主菌（如都是E.coli）的不同菌株，也会因遗传背景不同
18、而对重组质粒的稳定性有不同的影响。, 相对而言，重组质粒在大肠杆菌中比较稳定，而在枯草杆菌和酵母中较不稳定。,宿主细胞对克隆菌稳定性的影响,trpAE1：trpA-E缺失突变型 Ram：trp阻遏物琥珀型突变型 Tna：色氨酸合成酶缺陷突变型,不同宿主对质粒稳定性的影响,3、施加选择压力,从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。,1）抗生素添加法,通常在重组质粒上含有抗药性基因,AmpR,AmpR,TcR, 将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后，克隆菌也获得了抗药性。, 在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素，就可阻止丢失了重组
19、质粒的非生产菌的生长。,但这种方法在大规模生产时并不可取, 因为：, 成本增加 对于一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的选择压力只能维持一定的时间 添加抗生素对结构性不稳定无能为力 抗生素的存在可能会影响目的产物的合成给产物的提取带来困难,2）抗生素依赖变异法, 通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖型变异株即只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长。, 因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能达到消除重组质粒分配不稳定性 的目的。, 而重组质粒上含该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。,3）营养缺陷型法, 通过诱变使宿
20、主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因，而将该基因插入到重组质粒中。, 然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。,例如：构建 带有色氨酸操纵子的重组质粒pBR322-trp，并在该质粒上插入SerB基因；而宿主细胞是SerB缺陷型；这样质粒与宿主形成互补，在培养过程中丢失质粒的细胞因不能合成Ser而被淘汰.,4、控制基因过量表达,提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。,可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷贝数或转录、翻译效率使外源
21、基因高效表达。,1）可诱导性启动子, 在构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如：lac、 trp、 PL等, 在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去阻遏（诱导）使质粒高效表达。,例如： 利用3-吲哚乙酸可使trp启动子去阻遏,2）温度敏感型质粒,一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少，当温度升高到一定值时质粒大量扩增 脱缰质粒 （runaway plasmid）, 如：pKN410在30时的拷贝数为2050/E.coli细胞；在35时质粒大量复制。, 将-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增400倍。,5、控制培养条
22、件, 对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条件是进行工业化生产的关键 步骤。, 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的比生长速率3个方面尤其重要。, 环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属未知。,1）培养基的组成,2）培养温度,通常，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。,3）菌体比生长速率, 比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并可能与克隆菌本身和培养条件有关。例如: 在酵母系统中，大则质粒pJDB248稳定性高。, 如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果；调整这两种菌的比生长速率可以提高重组
23、质粒的稳定性。 但很难达到,五、工程菌外漏的防范,排气机械密封接种取样培养后的灭菌排液 （输至下一工序）,可能发生外漏的部位和操作：,1、排气, 气溶胶中含有较多的微生物 排气中的微生物数量随培养液中菌体浓度和通风速度等而变化。,排气鼓泡瓶（器）,1、培养罐 2、鼓泡瓶 3、膜滤器,排气加热,1、培养罐 2、电热器 3、温度传感器 4、湿度调节器 5、冷凝器 6、膜滤器,200,2、机械密封, 用于培养工程菌的发酵罐应使用双机械密封, 小型罐也可使用磁力搅拌，省却机械密封,3、取样, 普通培养罐的取样管道在取样时会流出样品；取样后对样品管道灭菌时，未灭菌的培养液污水被排至排水管。, 工程菌的取
24、样则要求更加严格,1、培养罐 2、连结器 3、样品管 4、样品管,供工程菌用的取样装置,4、培养后的灭菌,发酵罐、管道等清洗的所有废液都必须灭菌后方可排至排污管,5、接种,将种子瓶与培养罐以管相连接后，用无菌空气加压将种子压入发酵罐。,6、排液,培养开始前就将排液口与下段工序相连接并进行灭菌，这样培养一结束即可直接输送培养液。,六、工程菌的高密度培养,1、高密度培养（High cell-density culture; HCDC ）, 一般指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术。,基因工程菌广泛采用高密度培养技术,2、限制高密度的主要因素,1）营养成分 2
25、）抑制与阻遏 3）溶氧水平 4）有毒代谢物,3、实现高密度培养的措施,1）选择最佳培养基成分和含量,2）补料,3）富氧通气,4）防止有害代谢产物的影响,大肠杆菌在葡萄糖培养基中很容易积累乙酸，特别是供氧不足时；乙酸的积累会抑制大肠杆菌的生长并严重影响外源基因的表达。,限制碳源供应；提高溶氧；基因工程构建代谢旁路；发酵-透析藕合,发酵-透析藕合技术：, 将发酵液用透析膜与透析液隔开，随着培养的进行，菌体形成的小分子代谢产物通过透析膜进入透析液，从而降低了在发酵液中的浓度，有利于解除产物抑制。 如果在透析液中加入营养物质，则营养物质可反方向进入发酵液，供菌体利用（起到补料作用）。,发酵罐,透析罐,
26、透析膜,发酵与透析藕合,第二节 固定化细胞,Immobilized enzymeImmobilized cellImmobilized biocatalysts,一、固定化细胞的依据,4）微生物细胞具有维持其生命活动的完整的酶系统，各酶又严格地处于各亚细胞器上，酶促反应有着严格的顺序性，在制备固定化菌体细胞的过程中应尽可能完整地保持细胞的这种特定状态。,1）从广义上讲，微生物细胞所具酶系统相当于被一层层具有选择透性的胞膜或质膜所包埋，这些酶本身已经是固定化酶。,2）既然固定化细胞本身已经是一种固定化酶，如果设法除去细胞所特有的对细胞起自溶作用的酶系统，并防止外来细胞对它的侵袭，就能使此细胞反复
27、利用。,3）细胞膜（包括原生质膜、线粒体膜、核膜等）具有选择透性，往往阻止人们因生产某种产品所加特定底物的进入（不象尼龙），这是细胞固定化过程中需考虑的。,二、固定化细胞的制备方法, 与固定化酶的制备方法大体相同； 常用的有吸附法、包埋法、共价结合法、交联法、多孔物质包络法、超过滤法等，其中包埋法最为普遍。,良好固定化细胞方法的条件：,1）应该能够控制固定化细胞的大小和空隙度； 2）原料易得、成本较低，方法简便、易行，载体对细胞是惰性的，固定过程温和，对细胞损伤轻； 3）固定化细胞应具有稳定的网状结构，在所使用的pH值和温度下，不会被破坏； 4）在反应器内长时间运转过程中，固定化细胞具有良好的
28、机械稳定性和化学稳定性； 5）固定化细胞应使底物、产物和其他代谢物能够自由扩散，因为产物和其他代谢产物常能抑制细胞的酶反应； 6）单位体积的固定化细胞应拥有尽可能多的细胞。,一）吸附法,1、表面吸附法, 很多类型的微生物细胞，具有吸附在固体表面的天然倾向(牙菌斑形成等)； 供吸附细胞用的载体都是多孔性物质，如高岭土、多孔硅、聚氯乙烯碎片、活性炭、木屑、离子交换树脂、多孔玻璃等,2、 细胞聚集法, 某些细胞具有形成聚集体或絮凝物颗粒的倾向，当将它们进行长时间的悬浮培养，细胞浓度很高时，这种倾向更为明显。如某些酵母菌株能形成絮凝体，可以置于连续柱式反应器内生产酒精，非常稳定，且由于细胞浓度很高，生
29、物转化效率很高。, 在某些环境条件下，可以诱导形成微生物细胞聚集体例如，利用多聚电解质可以引起某些细菌形成聚集体,二）包埋法,1、凝胶包埋法,丙烯酰胺为单体，甲叉双丙烯酰胺为双功能交联剂； 具有良好的化学的、机械的和热的稳定性； 已应用于生产L-苹果酸、L-色氨酸、L-赖氨酸、L-瓜氨酸、衣糠酸、酒石酸、蛋白酶、淀粉酶等,1）聚丙烯酰胺凝胶,2）海藻酸钙凝胶,菌体与可溶性海藻酸钠混合，再与适当浓度的氯化钙溶液接触，形成海藻酸钙凝胶； 操作条件温和，对细胞损伤小； 但强度不高；为提高机械强度，可用带有碱性基团的聚乙烯亚胺溶液处理； 已用于酒精、啤酒、抗生素、酶制剂的生产,3）卡拉胶(Carrag
30、eenan),从皱波角叉菜(Chondrus crispus)分离的-角叉菜聚糖； 与金属离子(K+、NH4+、Ca 2+、Al 3+等)、脂肪胺、芒香胺、氨基酸衍生物以及可与水相混溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇、丙酮等）接触，即成凝胶。,4）琼脂糖胶,5）其它凝胶琼脂、壳聚糖、明胶、胶原、槐豆胶等,2、微胶囊法,利用半透性聚合物薄膜将细胞包裹起来，形成微型胶囊，直径一般在1100m。,三）共价结合法,利用细胞表面的化学基团，如氨基、羧基、羟基、巯基、咪唑基等，与已活化的无机载体或有机载体反应形成共价键，从而固定细胞。,四）交联法, 利用双功能或多功能试剂，直接与细胞表面的反应基团发生反应，使细胞
31、彼此交联，形成网状结构，即成固定化细胞； 常用交联剂：戊二醛、甲苯二异氰酸酯、双重氮联苯胺等。,五）多孔物质包络法, 利用一些能使细胞穿透入空隙，并在其中形成细胞群体的多孔物质来制备；多孔物质内的空隙必须足够大，以便使微生物细胞易于穿透进去，但空隙又不能太大，通常为细胞直径的数倍； 该法介于吸附法和包埋法之间，也有人将其归入包埋法； 常用多孔物质：棉布或尼龙布、金属丝网、各种类型的海绵和泡沫塑料等。,六）超过滤法, 利用超过滤膜（半透膜）也可将细胞固定起来。底物和产物可以自由进、出超过滤膜，而位于膜内的细胞并不能流出来； 此法常用于制备生物传感器和膜反应系统； 须注意控制细胞的生长，以免细胞浓
32、度过高，产生压力，引起超过滤膜的破裂。,三、固定化细胞的性质及优点,与游离酶和天然细胞相比，固定化细胞具有下列性质：,1）酶活力的稳定性增强,2）酶促效率明显增高,和固定化酶不同，菌体在固定化过程中通常不损伤细胞本身，细胞内的酶系统也最大限度地保持着天然状态,3）具有多步酶反应的特点,4）细胞透性和热稳定性增强,固定化细胞质膜的透性较天然细胞增强；热稳定性通常也比天然细胞提高,5）可连续使用,四、固定化细胞生产实例,固定化细胞技术已经在能源、医药、氨基酸、有机酸、酶制剂、污水处理等方面得到广泛应用。,能源：酒精、氢气 医药：氢化泼尼松、6-氨基青霉烷酸、棒曲霉素、杆菌肽 氨基酸：L-色氨酸、L
33、-赖氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、苏氨酸等 有机酸：醋酸、乳酸、苹果酸、衣糠酸、酒石酸等 饮料：啤酒 酶制剂：蛋白酶、淀粉酶,例如 酒精发酵1983年，日本率先采用固定化酵母，在4m3大小的流动柱床反应器，用甘蔗糖蜜生产酒精；酒精的转化率达到理论值的95%，生产能力超过常规批式发酵工艺的20倍；用海藻酸钙包埋的酵母，工作稳定性达4个月以上；用光交联树脂固定的酵母细胞工作稳定性达2年以上。优点：可获得高的细胞浓度；可加速反应速度；以高稀释率连续运转而不会发生流失现象；由于酒精不断被除去，没有终产物的抑制问题；又由于细胞被包埋在凝胶中，能造成厌氧的条件，不需造价昂贵的设备（发酵罐）。,五、共固定化技术,1
34、、概念,共固定化（Co-immobilization）-是将酶、细胞器和细胞同时固定于同一载体中，形成共固定化系统。, 这种系统稳定，可将几种不同功能的酶、细胞器和微生物细胞进行协同作用； 共固定化技术是在混合发酵技术和固定化技术的基础上发展起来的一门新技术，综合了混合发酵和固定化技术的优点。,2、共固定化的形式,1）细胞/细胞,如啤酒酵母与大肠杆菌,2）细胞/酶,如黑曲霉与过氧化氢酶,3）细胞器/酶,如叶绿体与氢化酶,3、共固定化技术的应用,例如： 纤维素分解常受其中间产物和末端产物葡萄糖的抑制若将酵母和纤维二糖酶一起共固定化，制得的新型生物反应器既能将纤维二糖转化成葡萄糖，同时还可以将葡萄糖发酵成酒精。这样便可消除纤维二糖水解产物葡萄糖的抑制作用，亦可进行连续发酵生产酒精。,
