1、脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus）分离鉴定研究进展专题论述食品科学 200Vo1.29,No.02487脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)分离鉴定研究进展岳田利,胡贻椿,袁亚宏,高振鹏(西北农林科技大学食品科学与工程学院,陕西杨凌 712100)摘要:脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus) 由于其耐热,嗜酸的独特生存能力而受到全球学术界和食品工业界的极大关注,本文系统介绍与分析了脂环酸芽孢杆菌的特征,结构,分类,分离方法,形态学,生理生化,生长条件,细胞膜脂肪酸组分分析,甲基萘醌分析,DNA 组成及杂交试验,16SrRNA/DNA 测序及系统发育分析
2、鉴定方法,提出了我国应着力进行的几个研究领域: 脂环酸芽孢杆菌属新菌资源的开发:脂环酸芽孢杆菌属细胞膜中 u 一环状脂肪酸和藿烷类化合物的功能研究;脂环酸芽孢杆菌属快速检测方法研究;脂环酸芽孢杆菌属各菌种代谢动力学和基于代谢产物的快速检测技术;脂环酸芽孢杆菌属控制技术方法研究;脂肪酸芽孢杆菌热稳酶研究及工业化应用.关键词:脂环酸芽孢杆菌;果 7t;分离;鉴定ReviewonIsolationandIdentificationofAlicyclobacillusYUETianli,HUYichun,YUANYahong,GAOZhenpeng(CollegeofFoodScienceandEng
3、ineering,NorthwestAFUniversity,Yangling712100,China)Abstracts:Thethermophilic,aciduricAlicyclobacillusspp.arebecomingincreasingconcernsintheglobalacademiaandfoodindustry.Thestructure,classification,isolationmethods,morphology,biochemicalandphysiologiccharacteristics,growthconditionofAlicyclobacillus
4、spp.areintroducedinthispaper.Andtheanalyticmethodsofcellularfattyacid,menaquinone,DNAcomposition,DNAhybridization,16SrRNA/DNAsequencingandsystematicphylogenyarealsoincludedhere.Thefollowingstudyshouldbefocusedon:thedeveopmentofnewAlicyclobacillusspecies;thefunctionsof(1)一 alicyc5cfattyacidandhopanoi
5、dincellmembrane;studyonquickdetectionmethodsofAlicyclobacillusspp.; themetabolicdynamicsofAlicyclobacillusspp.andquickdetectionmethodsbasedonthemetabolites;(studyoncontrollingtechnologyofAlicyclobacillusspp.: researchonthermostableenzymesderivedfromAlicyclobacillusstrainsanditsapplication.Keywords:A
6、licyclobacillus;isolation;identification;prospect中图分类号:TS201.3 文献标识码:A 文章编号:10026630(2008)02048706脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)是脂环酸芽孢杆菌属,革兰氏阳性(仅一株 A.sendaiensis 为革兰氏阴性)芽孢杆菌.人们根据其耐热,耐酸的特点,俗称为耐热菌,耐热耐酸菌,嗜酸耐热菌,嗜热耐酸菌等.脂环酸芽孢杆菌主要分布于高酸的热环境,土壤及水果加工产品中,如苹果,桔子,芒果等【5.】.该属的酸土脂环芽孢杆菌(A.acidoterrestris),酸热脂环芽孢杆菌(A.口 cl
7、Dc 口 Z 口 rf“)等可以引起巴氏灭菌果汁的腐败【5.81,产生难以接受的气味,这种腐败在初期并不容易被发现,产品并不出现明显的涨包或酸败,但其代谢产物在万亿分之一浓度就会使果汁口感风味变劣,产生浊度升高乃至在包装物底部形成白色沉淀等质量危害【9.1o.该属其他菌株对果汁也存在潜在的危害,芽孢可污染果汁生产中的半成品和生产材料,包括浓缩苹果汁和加工用水等,其在低污染时难以检出,使得产品流通到消费者手中腐败才会被发现,因而商家往往是接到消费者的投诉之后才会意识到产品的腐败】,这种由脂环酸芽孢杆菌属引起的果汁腐败现象在世界各国相继出现,是近年来浓缩果汁生产厂家比较棘手的常见污染菌,国际贸易严
8、格要求每 10ml 浓缩果汁中该菌的含量收稿日期:2007 一 Oll2基金项目:国家西部项目(2OOlBA9OlAl9);霍英东基金(81065);国家“十五科技攻关项目(2OOlBA5OlAl5.2.3)作者简介:岳 RqlJ(1966 一),男,教授,主要从事食品生物工程技术及食品安全学研究.E.mail:.ca4882008,Vo1.29,No.02 良品科学专题论述不大于一个【312】.脂环酸芽孢杆菌因其独特的生存能力引起了全球食品工业的极大关注,同时也引起了国际学术界的广泛研究.1 脂环酸芽孢杆菌的发现与分类1971 年 Darland 和 BrockU31 在美国的酸热环境中分离
9、到芽孢杆菌 Bacillusacidocaldarius,该菌细胞膜中具有独特的一环己烷脂肪酸结构和藿烷化合物结构,且这种菌只在酸热的环境中存在,故名为酸热脂环芽孢杆菌.1984 年 Cerny 等141 在腐败的苹果汁中也分离得到一株细胞膜中含一环己烷脂肪酸结构的芽孢杆菌,这似乎暗示着该菌导致了苹果汁的腐败.而此前 Hippchen 等】也从土壤中分离到了与之十分相似的菌株,但是由于当时没有测定碱基对(G+c)%的含量,所以无法确定它们与 B.acidocaldarius 之间的关系 .1987 年 Deinhard 等】将前三人分离的菌株及其他耐酸耐热的杆菌共 13 株,做了全面的鉴定,结
10、果表明:在这 13 株菌中有一株与 B.acidocaldarius 十分相似,细胞膜中也具一环己烷脂肪酸和藿烷结构,由于该菌株主要是从土壤中分离得到,因此命名为酸土芽孢杆菌 B.acidoterrestris.这两株菌区别就在于它们利用的碳源不同.随后 Deinhard 等 161 又鉴定出芽孢杆菌族的新成员环庚烷芽孢杆菌 B.cycloheptanicus,其细胞膜中具有一环庚烷脂肪酸结构.1992 年 Wistozkey 等 I“对 B.acidocaldarius,B.acidoterrestris,B.cycloheptanicus 的一级结构和二级结构进行了 16SrDNA 相对序
11、列分析,结果表明这三株菌的二级结构相似性极高,但与芽孢杆菌属的其他菌相似性并不高,加上它们的细胞膜中都具有一环状脂肪酸结构,因此将这三株菌从芽孢杆菌属中划分出来,命名为脂环酸芽孢杆菌属(AffcycfD6 口 cfff“).这三株菌分别更名为 A.acidocaldarius,A.acidoterrestris,A.cycloheptanicus,随后该属又有更多菌种被发现 .1998年 Nicolaus 等181 在南极洲 Rittmann 山附近发现一株 A.acidocaldarius 的亚种 A.acidocaldariussubsp.rittmannii;2000 年 Albuque
12、rence 等【l9】从亚速尔群岛的火山附近的土壤中分离得到的 A.hesperidum,由亚速尔群岛美丽传说中的金苹果仙女而得名,和另一株基因型1,由于该菌的几项重要判定指标接近于临界点,因而没有正式命名,暂时命名为脂环酸芽孢杆菌基因型 1;2002 年 Goto 等201 从日本一种芙蓉属的干花茶中分离得到A.herbarius,由其来源得名;2002 年 Matsubara 等211 从日本酸饮料中分离出 A.acidiphilUS,由其强嗜酸性得名;2002 年 Goto 等22】在日本分离出脂环酸芽孢杆菌基因型 2,也是暂时命名;2003 年 Tsuruoka 等231 从日本仙台火
13、山附近分离出一株嗜酸轻微耐热菌 A,sendaiensis,由分离地仙台得名;2003 年 Goto 等【24】在混合酸性果汁中分离出一种不含一环状脂肪酸结构的嗜酸耐热内生孢子菌 pomorum,得名于日本的一种水果,并由此对该属进行了修正说明,即该属菌株细胞膜含有一环状脂肪酸和少量直链或支链饱和脂肪酸,也有部分菌株是只含有直链或支链饱和脂肪酸;2004 年 Simbahan 等251 在美国加利福尼亚州 Coso 热泉附近分离得到 A.vulcanalis,由其分离白火山附近而得名.至此脂环酸芽孢杆菌属共有11 个种,一个亚种,该属新菌株资源的发现仍然在继续进行当中.2 脂环酸芽孢杆菌的鉴定
14、及其系统发育的研究对于该菌属的鉴定有传统鉴定方法和现代鉴定方法,研究者通常采用两种鉴定方式相结合.传统鉴定方法包括:形态,生理生化特征鉴定等.现代鉴定技术有细胞膜脂肪酸组分分析,甲基萘醌分析,DNA 组成及杂交试验和 16SrDNA 序列分析等.2.1 菌种分离为了分离得到脂环酸芽孢杆菌的各种菌株纯种,研究者一直在研究各种合适的培养基.虽然脂环酸芽孢杆菌可以生存在高温高酸的条件下,但是在某些特殊的培养基上却不能生长的.如 A.acidoterrestris 不能生长于含胰酶解酪蛋白,牛肉汤琼脂的培养基中,甚至当 pH值达到 pH3.5 时也无法生长】.目前研究出来分离脂环酸芽孢杆菌的常用培养基
15、有:BAM(BacterfaAcidocaldariusmedium)Darland 等131 用 BAM 分离出了第一株脂环酸芽孢杆菌 A.acidocaldarius,这是最早也是目前比较通用的脂环酸芽孢杆菌分离基础培养基;OSA(orangeserumagar)in1 最初是用于分离桔汁中的微生物,也应用于分离脂环酸芽孢杆菌,但是其分离效果不如BAM;PDA(patatodestroseagar)t261 用于分离脂环酸芽孢杆菌的 PDA 要将 pH 值调至 3.5,且分离的脂环酸芽孢杆菌具有良好的再生性;YSG(yeaststarchglucose)211最早是由日本学者用于分离酸性饮
16、料中的脂环酸芽孢杆菌;K 氏培养基271 是目前应用最为广泛的培养基,比起其他培养基来,它能更快速的得到目的菌而且菌株有良好的再生性.当然各国研究者们也在研究能更快速有效分离脂环酸芽孢杆菌的培养基.如 ChangS 等281 优化得到的 SK 琼脂培养基就具高灵敏度和低检测限等特点.2I2 形态学鉴定各菌株于培养基 45需氧培养,15】,两天即可长出明显菌落.菌落形态一般为圆形饱满,乳白色,半透明或不透明,直径为 0.55mm,细胞形态为杆状,产芽孢,芽孢呈椭圆形杆状,端生或次端生,有时会使营养细胞膨大,好气生长,菌体宽 0.351.1lam,长26.3m.专题论述食品科学 2008,VoL2
17、9,No.024892.3 生长条件试验常采用 BAM 液体培养基或 BAM 琼脂培养基 fl5.细菌生长温度范围研究将细菌培养液于不同温度下水浴培养,pH 值固定为 4,分光光度计测定 OD 值,测定时波长并不统一,如 Darland 等【l31 采用 540rim,Goto 等【20】采用 578nm,视各仪器的具体情况而定.我们可以根据菌体浊度得知细菌的最适生长温度;最适 pH 值测定时,将温度设定在 50或 60,lmol/L 或 2mol/L 的 H2SO4 调节培养的 pH 值,培养 1d,测定 OD 值 D5s】,可以得知菌种的适宜生长 PH 值.该属生长条件见表 1.表 1 脂
18、环酸芽孢杆菌各菌种生长温度,DH 值范围Table1GrowthtemperatureandpHrangeofAlicyclobacil/usspecies2.4 生理生化鉴定常采用 API50CHB 系统进行鉴定 fl5_25】,API50CHB培养基是用来研究芽孢杆菌对 49 种碳源(糖,醇)利用情况进行测定的一种快速检测培养基,用被测的微生物在培养基中制成菌悬液,接种于试验条的每一个管.培养期间,糖发酵产酸,致使 PH 下降,以指示剂的颜色变化予以表示.结果组成该菌株的生化图谱,并用它来鉴定或分型293.有的菌株根据各种糖醇利用的情况就可以直接鉴定出种,由于脂环酸芽孢杆菌的部分菌株之间糖
19、利用情况的差异并不显着,往往还要进一步的鉴定.如果个别糖醇的反应并不明确,我们还可以直接将目标碳源(糖,醇) 以 2g/L 直接加入 BAM 基础盐培养基中培养菌种,每隔 7d 测量 pH 值203,来判断其碳源利用情况.2.5 细胞膜脂肪酸组分分析脂肪酸组分分析使用的培养基也是 BAM 基础培养基,将其转化为脂肪酸甲基酯后测定.通过皂化,甲基化后提取脂肪酸甲基酯,用气相色谱质谱仪测定(GC.MS)脂肪酸的类型及含量15.s-3o3.脂环酸芽孢杆菌属各菌种的脂肪酸含量及类型综合如表 2.2.6 甲基萘醌分析微生物醌是能量代谢过程的电子传递体,不同的微生物含有不同种类和分子结构的醌,因此,微生物
20、醌的组成,即醌指纹可以在一定程度上反应微生物的群体结构311. 微生物醌的分析分 3 个步骤,即醌的萃取,分离提纯和定性与定量分析【321,用于分析的培养基为BAM 培养基15-251,经培养,冷冻干燥处理后的细菌干细胞用少量氯仿.甲醇(2:1,v/v)萃取之后,过滤细胞一溶剂混合物,滤去细胞碎片,收集滤液,加压蒸馏表 2 细胞膜脂肪酸含量及类型Table2CellularfattyacidcompositionofAlicyclobacillusspecies脂肪酸含量(%)1234567801.20.8 一一 0.4 一一一01.70.6 一一一一1.73.21.79.72.42.10.9
21、5.11.51.70.52.11.52.51.3 一一 2.41.42.20.50.80.55.41.70.41.40.82.800.51.01.43.80.82.65.11.22.02.70.95.60.62.64.98.33.29100.50.51.4廿1.319.918-313-3廿anteiso.CI5.00.5anteiso-C1700.7.cyclohexaneC17o47.8.cyclohexaneC19:025.2-cycloheptaneCl,o-cycloheptaneC1,o2OH-cycloheptaneCj.=o1.2O.51.1tr6.66.73.26.51-310.352.862.671.456.842.618.925.813.386.8 一一2-3 一一廿一0.88.453.125.8廿3.0一67.13.54.50.32.682.612.30.50.747.642.60.24.90.60.91.11.64.51.510.544.130.29.934.21.54.28.30.7
