1、呼吸机相关性肺炎患者血与痰标本中分 离的鲍曼不动杆菌分子流行病学分析 王露霞 郑英俊 郭振辉 李理 王晓雅 李建勋 卓超 广州军区广州总医院检验科 中国人民解放军 69210 部队医院 广州军区广州总医院 MICU-广东省老年感 染与器官功能支持重点实验室 广州军区广州总医院 呼吸科 广州医科大学第一附属医院呼吸疾病研究所 摘 要： 目的 对照分析 ICU、内科ICU呼吸机相关性肺炎 (VAP) 患者的血标本和痰标本 分离的鲍曼不动杆菌分子流行病学特点与患者临床特征。 方法 研究分两组:同一 患者、同期从痰标本和血标本分离出鲍曼不动杆菌患者为 A组;同一患者仅痰标 本分离鲍曼不动杆菌、而血标本
2、未分离出该菌患者为 B组。收集患者临床信息, 检测菌株体外药敏, 并进行脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 和多位点序列分型 (MLST) 。结果 2015 年6-12月入选A组患者 14例, 获得非重复菌株 28株;入 选B组患者 28例, 获得非重复菌株28株。两组分离的 56株鲍曼不动杆菌全部 为多重耐药株, 除对替加环素高度敏感外, 对碳青霉烯类、 第三代头孢菌素和氨 基糖苷类的耐药率都在 80%以上, 两组分离株的药敏谱无统计学差异。A组同一 患者两种标本获得的鲍曼不动杆菌非重复株经 PFGE证实均为同源株, 28株菌共 有6个克隆型。B组 28株菌按PFGE分为9个克隆型, 其中有5个克
3、隆与 A组的 克隆型相同。MLST 分析, A组菌株共分为9 个ST型 (ST 195、ST 208、ST 229、 ST 369、ST 373、ST 457、ST 836和2个新 ST型ST N2、ST N5) ;B 组菌株共 分为8 个 ST型 (ST 195、ST 208、ST 381以及 5个新ST型ST N1、ST N2、ST N3、 ST N4、ST N5) 。两组主要 ST型的比例差异无统计学意义。经 e BURST 分析, ST 195、ST 208、ST 457、ST 369、ST N1、ST N2、ST N51均属于CC92 流行株。 结论 广州军区广州总医院 ICU 患者
4、血与痰标本分离的鲍曼不动杆菌在药敏谱、 基因分型上高度相似, 病房存在CC92流行株的传播。VAP患者合并血流感染的 危险因素与菌株基因型无直接关系。 加强医院感染控制对防治鲍曼不动杆菌血流 感染尤为重要。 关键词： 鲍曼不动杆菌; 多位点序列分型; 血流感染; 临床分析; 作者简介：王露霞 (1960) , 女, 本科, 副主任技师, 主要从事临床微生物检 验。 作者简介：卓超, E-mail:。 基金：广州市科研条件建设项目 (穗科信字 2012224-5) Molecular epidemiological analysis of the Acinetobacter baumannii
5、isolates from blood and sputum specimens of patients with ventilator-associated pneumonia WANG Luxia ZHENG Yingjun GUO Zhenhui LI Li WANG Xiaoya LI Jianxun ZHUO Chao Department of Laboratory Medicine, General Hospital of Guangzhou Military Command; Abstract： Objective To investigate the molecular ep
6、idemiological characteristics of the Acinetobacter baumannii strains isolated from blood and sputum samples of patients with ventilator-associated pneumonia (VAP) in ICU. Methods The patients were analyzed in two groups: Group A, A. baumannii was isolated from both blood and sputum, and Group B, A.
7、baumannii was isolated only from sputum. Clinical data of the patients were collected, including the results of antimicrobial susceptibility test. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) and multilocus sequence typing (MLST) were performed for the strains. Results During the study period from June 2
8、015 to December 2105, 28 nonduplicate A. baumannii strains were collected from 14 patients in group A and 28 nonduplicate strains from 28 patients in group B. The 56 A. baumannii strains were multidrug-resistant (MDR) . More than 80% of the strains were resistant to carbapenem, third-generation ceph
9、alosporins or aminoglycoside, but highly sensitive to tigecycline. No significant difference was found for the resistance rates between group A and group B. The nonduplicate A. baumannii isolates from blood and sputum samples of the same patient in group A were all homologous strains confirmed by PF
10、GE. Six pulsotypes were identified from the 28 strains in Group A and 9 pulsotypes in Group B. Five pulsotypes were shared between the two groups. MLST analysis showed that there were 9 ST types (ST195, ST208, ST229, ST369, ST373, ST457, ST836 and two new phenotypes ST N2, ST N5) in Group A and 8 ST
11、 types (ST195, ST208, ST381 and 5 new phenotypes ST N1, ST N2, ST N3, ST N4, ST N5) strains in group B. There was no significant difference in the proportion of the main ST types between the two groups. e BURST analysis indicated that ST195, ST208, ST457, ST369, ST N1, ST N2, ST N51 belonged to CC92
12、 prevalent strain. Conclusions The antimicrobial susceptibility profile and genotype of A. baumannii isolates from blood and sputum samples are similar. There was CC92 prevalent strain in the ward. There is no direct relation between the risk factors for bloodstream infection in VAP patients and the
13、 genotype of A. baumannii strain. It is particularly important to reinforce infection control for prevention and treatment of A. baumannii bloodstream infections. Keyword： Acinetobacter baumannii; multilocus sequence typing; bloodstream infection; clinical analysis; 鲍曼不动杆菌是临床重要条件致病菌, 具有容易获得耐药性及传播的特点
14、。 感染 类型包括医院获得性肺炎 (HAP) 、尿路感染、中枢神经系统感染、创口感染、 菌血症等, 尤以呼吸机相关性肺炎 (VAP) 最常见。一项亚太地区有关 HAP/VAP 流行病学调查 (ANSORP) 表明鲍曼不动杆菌的分离率在HAP/VAP居于前3位, 约 20%40%, 其中中国HAP/VAP的分离率都居第1位, 分别为16.2%和35.7%, 且几 乎全为多重耐药株, 对碳青霉烯类耐药率超过 50%1。鲍曼不动杆菌 HAP/VAP 合并血流感染带给临床更大的挑战, 其病死率高于单纯 HAP患者, 并且鲍曼不 动杆菌性肺炎继发血流感染的病死率 (35.6%) 也高于其他原因所致的鲍曼
15、不动 杆菌血流感染病死率 (7.3%) 2。鲍曼不动杆菌 HAP进展为HAP合并血流感染 的机制并不清楚, 虽然有报道提示, 初始不恰当的抗生素治疗、 严重的基础疾病 等临床危险因素可导致鲍曼不动杆菌 HAP进展为菌血症3-4, 但有关病原学本 身在其中所起作用却鲜有报道。 为此, 本研究通过对照研究, 从鲍曼不动杆菌的 分子流行病学特征入手, 研究病原学在鲍曼不动杆菌肺炎进展到合并血流感染 中所起作用, 为临床早期防控鲍曼不动杆菌感染提供实验室依据。 1 材料与方法 1.1 菌株来源 所有菌株来自2015 年6-12月入住我院ICU、内科 (M) ICU VAP患者痰培养、血 培养分离出的鲍
16、曼不动杆菌, 剔除来自同一患者同一标本的重复菌株。3株参考 菌株:不动杆菌基因种型 13TU (Acinetobacter nosocomialis) 、不动杆菌基因 种型3 (Acinetobacter pittii) 和鲍曼不动杆菌由浙江大学邵逸夫医院俞云松 教授惠赠。 1.2 研究方法 1.2.1 病例分组和诊断标准 入选患者符合美国 ATS/IDSA 2005年HAP/VAP 诊断标准5。若患者符合相隔 48 h内出现血培养及痰培养鲍曼不动杆菌阳性两个条件, 且血培养阳性为双瓶以 上, 归为 VAP合并血流感染组, 称A组;若患者血培养为阴性, 仅痰培养出鲍曼 不动杆菌为B组 (鲍曼不
17、动杆菌呼吸感染/定植) 。若患者血培养有鲍曼不动杆 菌以外的细菌则不纳入本研究分析。 1.2.2 临床资料收集 查阅患者临床资料、 实验室数据。 统计两组患者基本信息, 入住ICU、 MICU时间, 是否接受侵袭性操作以及采取痰或血标本日期1 d的各项临床征象等指标。 1.2.3 菌株鉴定和药敏试验 菌株鉴定及药敏采用全自动微生物系统VITEK 2-Compact仪器 (法国生物梅里埃 公司) 。有关鲍曼不动杆菌复合体中 3个基因型 (13TU、不动杆菌基因种型 3 和鲍曼不动杆菌) 的鉴定则参照文献6方法以 16S-23S r RNA予以分类。质控 菌株为铜绿假单胞菌 ATCC27853和大
18、肠埃希菌 ATCC25922。 1.2.4 脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 参照文献7:制备胶块、裂解细胞、洗胶、胶块 DNA酶切、加样、电泳等; (1) 条 带完全相同判断为克隆株; (2) 条带差异13 条判断为克隆亚型; (3) 条带差异 46条判断为可能克隆亚型; (4) 条带差异大于 7条以上判断为非克隆株。用生 物学软件Bio Numerics结合肉眼比对将PFGE结果进行非加权组平均法 (UPGMA) 进行聚类分析。 1.2.5 多位点序列分型 (MLST) 分析提取细菌DNA模板, 参照文献报道制定的 MLST引物设计方案8, PCR扩增 glt A、gyr B、gdh B、re
19、c A、cpn60、gpi、rpo D共7个管家基因, 引物见表 1。PCR 扩增产物进行测序, 产物序列与鲍曼不动杆菌 MLST数据库 (http:/pubmlst.org/abaumannii/info/primers.sht) 进行比对。 若 MLST数据 库中查找不到测序结果所得到的ST型, 经核实后, 确认为新的ST型, 新的管家 基因序列和ST型及菌株相关资料上传到数据库。 1.2.6 数据统计分析 采用WHONET 5.6进行药敏数据分析, 采用SPSS17.0进行原始数据分析, 计量资 料比较采用t检验, 不同分类构成比的计数资料比较采用卡方检验。 危险因素分 析采用COX回归
20、分析。以 P0.05) 。见表3。 2.3 菌株 PFGE分析 A组14例患者的各自血与痰标本分离株均为同一克隆;28株菌株分为6个克隆型, A、B、C、D、E、F 型克隆株分别为8株、6 株、4株、4株、4株、2株;B组28 株分为9个克隆型, 其中包括A组中A-E 5 个克隆型, 共21株, 其余 7株为G 型 (3 株) 、H型 (2 株) 、J型 (1株) 和 K型 (1株) 。 2.4 MLST 分型 56株鲍曼不动杆菌通过 MLST分为13个ST 型, 其中ST 195、ST 208、ST 457、 ST N2构成比分别为 28.57%、19.05%、11.90%、14.29%,
21、为主要流行株。有 5 个新的ST型 (分别以 N1、N2、N3、N4和N5 表示) , 其已知ST型仅有 1个或2 个管家基因的差别, 亲缘关系较近, 多见于管家基因 gpi和gyr B的差异。A组 与B组的 ST 195、ST 208、ST457、ST N2主要流行株的分布差异无统计学意义 (P 0.05) 。见表4。 表2 A组与B组各项临床指标对照比较Table 2 Clinical data compared between patients with A.baumannii isolates from blood and sputum and those with A.baumann
22、ii isolates only from sputum 下载原表 表3 两组分离鲍曼不动杆菌对常见抗菌药物的耐药率比较 Table 3 Antimicrobial resistance rates of Acinetobacter baumannii isolates compared in terms of specimen source 下载原表 2.5 MLST 分型同源性分析 结合分型结果和Pub MLST 数据库, 使用e BURST 软件进行菌株基因同源性分析, 56株鲍曼不动杆菌共发现 13个ST型, 其中 7个ST型 (ST195、 ST 208、 ST 457、 ST 36
23、9、ST N1、ST N2、ST N5) 属于克隆复合体 92 (clonal complex 92, CC92) , CC92不同 ST型关系进化见图 1, CC92占所有菌株的 83.3%。属于同一个克隆复 合体的各个ST型之间仅有 1个或2个管家基因的差别, 亲缘关系较近, 多见于 管家基因gpi和gyr B 的差异。CC92菌株比例在 A组和B组中的分布, 并未发 现差异 (P0.05) , 见表4和图1。 3 讨论 鲍曼不动杆菌是我国近年医院感染中最常见的、最难治疗的细菌之一。一方面, 鲍曼不动杆菌几乎都为多重耐药, 且对碳青霉烯类耐药率也超过 50%, 使临床 可选用的抗菌药物很有
24、限;另一方面, 该菌最常见于患者下呼吸道, 临床很难判 断其是感染菌还是定植菌, 常导致过度治疗或治疗不足的矛盾。 然而, 近年流行 病学调查发现, 鲍曼不动杆菌血流感染的比例呈上升趋势, 大多继发于 HAP或 VAP, 而且与单纯的肺炎相比, 患者往往感染严重, 病情进展快, 病死率较高 1。据文献报道, 患者入住ICU时间、机械通气、行连续肾脏替代疗法、置中 心静脉导管为鲍曼不动杆菌血流感染的危险因素9。同时, 来源于血流感染的 鲍曼不动杆菌也常表现为多重耐药甚至广泛耐药, 使临床治疗更是面临困境。 一 项有关肿瘤患者合并广泛耐药鲍曼不动杆菌菌血症的临床研究显示, 63%患者在 确诊血流感
25、染后给予了恰当的抗菌药物 (包括多黏菌素) , 但30 d 病死率仍然达到83.7%, 且死亡原因主要与感染严重有关10。本研究也发现, 来源于VAP 合并血流感染组患者的 14 d病死率达50%, 而未合并血流感染组患者的 14 d病 死率仅为14%。虽然比较两组多项与血流感染有关的危险因素, 未发现有统计学 差异, 但这不排除本研究样本量较小所致的统计偏倚。 表4 A 组与B组各ST 型分布比较Table 4 Distribution of ST types compared between Acinetobacter baumannii strains in terms of speci
26、men source 下载原表 图1 56 株鲍曼不动杆菌基因同源性分析结果 Figure 1 Analysis of the genetic homology for 56 strains of Acinetobacter baumannii 下载原图 The dots in the green box belong to the ST types identified in this experiment.The dot size indicates the number of the strains belonging to the specific ST type in this ex
27、periment. 有关鲍曼不动杆菌血流感染的危险因素多集中于宿主因素分析, 而关于病原学 分子特征的分析报道较少。Chuang等11分析了鲍曼不动杆菌复合体中 3个种 类致菌血症患者的临床特征, 发现多重耐药株多出现于鲍曼不动杆菌, 而且患 者的病死率也高于种型 13TU和种型3。本研究也得到类似结论, A组和 B组菌株 几乎都属于鲍曼不动杆菌, 而且多为多重耐药株。 为此, 进一步对两组鲍曼不动 杆菌进行ST型分析, 发现ST 195、ST 208、ST 457、ST N2型占到了总菌株数 的73.8%, 为主要流行株。而既往报道, ST195 及ST457也正是广东省鲍曼不动 杆菌最常见
28、的ST型序列12, 由此也提示, 主流克隆株的长期存在是导致临床 鲍曼不动杆菌感染/定植高发的重要原因。同时, 发现两组中ST型分布无差异, 均以ST 195、ST 457、ST N2为主要ST型, e BURST 分析显示这几种 ST型属于 CC92, CC92不仅在国内表现为主要的流行克隆复合体, 同时也呈现全球范围流 行趋势13-14。CC92 群中两个管家基因gpi 和gyr B容易突变, 衍生更多的新 亚型, 如本研究发现的 STN1、STN2和STN5。因此, 加强对鲍曼不动杆菌 CC92 克隆的主动监控, 防止其在病区内传播, 对于降低鲍曼不动杆菌感染和病死率 尤为重要。 总之,
29、 通过对照研究, 分析鲍曼不动杆菌在肺炎合并血流感染中, 细菌分子流 行病学特征, 结果表明, 本研究并未发现国外报道的高毒力鲍曼不动杆菌 ST10 型菌株15, 本院鲍曼不动杆菌肺炎合并血流感染仍以 CC92流行克隆为主。而 宿主方面的病情程度是合并血流感染的主要危险因素。 参考文献 1KIM UJ, KIM HK, AN JH, et al.Update on the epidemiology, treatment, and outcomes of carbapenem-resistant Acinetobacter infectionsJ.Chonnam Med J, 2014, 50
30、(2) :37-44. 2CHUNG DR, SONG JH, KIM SH, et al.High prevalence of multidrug-resistant nonfermenters in hospital-acquired pneumonia in AsiaJ.Am J Respir Crit Care Med, 2011, 184 (12) :1409-1417. 3MAGRET M, LISBOA T, MARTIN-LOECHES I, et al.Bacteremia is an independent risk factor for mortality in noso
31、comial pneumonia:a prospective and observational multicenter studyJ.Crit Care, 2011, 15 (1) :R62. 4LEE HY, CHEN CL, WU SR, et al.Risk factors and outcome analysis of Acinetobacter baumannii complexbacteremia in critical patientsJ.Crit Care Med, 2014, 42 (5) :1081-1088. 5American Thoracic Society, In
32、fectious Diseases Society of America.Guidelines for the management of adults with hospitalacquired, ventilator-associated, and healthcare-associated pneumoniaJ.Am J Respir Crit Care Med, 2005, 171 (4) :388-416. 6LIN YC, SHENG WH, CHANG SC, et al.Application of a microsphere-based array for rapid ide
33、ntification of Acinetobacter spp.with distinct antimicrobial susceptibilitiesJ.J Clin Microbiol, 2008, 46 (2) :612-617. 7TENOVER FC, ARBEIT RD, GOERING RV, et al.Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis:criteria for bacterial strain typingJ.J Cli
34、n Microbiol, 1995, 33 (9) :2233-2239. 8BARTUAL SG, SEIFERT H, HIPPLER C, et al.Development of a multilocus sequence typing scheme for characterization of clinical isolates of Acinetobacter baumanniiJ.J Clin Microbiol, 2005, 43 (9) :4382-4390. 9周泓羽, 袁喆, 杜渝平, 等.鲍氏不动杆菌医院感染危险因素的荟萃分析J. 中华医院感染学杂志, 2013, 2
35、3 (2) :295-297. 10FREIRE MP, DE OLIVEIRA GARCIA D, GARCIA CP, et al.Bloodstream infection caused by extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii in cancer patients:high mortality associated with delayed treatment rather than with the degree of neutropeniaJ.Clin Microbiol Infect, 2016, 22 (4) :
36、352-358. 11CHUANG YC, SHENG WH, LI SY, et al.Influence of genospecies of Acinetobacter baumannii complex on clinical outcomes of patients with Acinetobacter bacteremiaJ.Clin Infect Dis, 2011, 52 (3) :352360. 12林倍州.细菌耐药监测分析暨重症监护病房 HAP合并鲍曼不动杆菌血流感染 临床分析及分子流行病学调查D.广州医科大学, 2015. 13ZHONG Q, XU W, WU Y, et
37、 al.Clonal spread of carbapenem nonsusceptible Acinetobacter baumannii in an intensive care unit in a teaching hospital in ChinaJ.Ann Lab Med, 2012, 32 (6) :413-419. 14HE C, XIE Y, FAN H, et al.Spread of imipenem-resistant Acinetobacter baumannii of European clone II in western ChinaJ.Int J Antimicrob Agents, 2011, 38 (3) :257-260. 15OU HY, KUANG SN, HE X, et al.Complete genome sequence of hypervirulent and outbreak-associated Acinetobacter baumannii strain LAC-4:epidemiology, resistance genetic determinants and potential virulence factorsJ.Sci Rep, 2015, 5:8643.
