1、植物细胞内质网衍生结构的多样性安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.201l,39(11):63016304,6321 责任编辑陈玉敏责任校对马君叶植物细胞内质网衍生结构的多样性齐束男,贾美慧,屠宝玉,李立新(东北林业大学盐碱地生物资源环境研究中心,东北油田盐碱植被恢复与重建教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150040)摘要对储藏蛋白质,水解酶和其他内质网衍生结构的储存与运输结构进行分析,并对其发展前景进行展望.关键词内质网(ER);PAC;MAG2;KDELvesicle中图分类号 X188 文献标识码 A 文章编号 05176611(2011)110630104Div
2、ersitvofPlantCellEndoplasmicReticulumDerivativeStructureQIShu.nanetal(AlkaliSoilNaturalEnvironmentalScienceCenterofNortheastForestryCniversity,KeyLaboratoryofSalinealkaliVegetati0nEeologyRestorationinOilFieldofMinistryofEducation,Harbin,Heilongjiang150040)AbstractTheDreservatio13andtransportationstr
3、uctureofprotein,hydrolyticenzymesandotherendoplasmicreliculumderivativestructurewereexpoundedinthispaper.Inaddition,theirdevelopmentdirectionwasexplored.KeywordsER;PAC:MAG2;KDELvesicle内质网(Endoplasmicreticulum, 简称 ER)是由 Porter 等(1945)首次发现的细胞器 ,是细胞的内膜系统的一部分,由管状,腔囊状以及囊泡状膜结构相互连接,在细胞内形成互联网,负责蛋白质的合成,折叠,修饰
4、,糖类脂类物质的合成和代谢等,在某些细胞中还参与药物的解毒作用.在长期的进化过程中,动物和植物细胞的内质网逐渐有了差异.植物细胞的内质网更加复杂并具有更大的灵活性,使植物能够有效地应对内部和外界环境的胁迫.为了应答胁迫,植物细胞内质网分化出很多不同种类的细胞结构,主要是储存由内质网不断合成的大量蛋白质.内质网衍生结构内含物有 2类,储藏蛋白质和水解酶,如 Precursoraccumulating(PAC)vesicle,Proteinbody 和 MAIGO2(MAG2)body 等含有大量种子储藏蛋白质或前体,ERbody,HDELvesicle 等含有大量水解酶(图 1).每一种结构都有
5、各自不同的功能,有些是细胞本身固有的结构,有的是外源基因导人或基因缺失等原因诱导形成的,其直径为 0.1l0m,具有共同的特征.首先,这些结构都选择性地积累大量蛋白质,种类单一或只有少数几种;其中含有的即使是功能性蛋白(比如酶),也不发挥活性;另外,衍生结构具有时空特异性,在特定的组织和发育阶段才形成.1 储藏蛋白质的大量储存与运输结构1.1PACvesiclePACvesicle 是发育中的南瓜种子中发现的 ER 衍生结构,直径为 200400HB,具有高电子密度的核心,外周电子密度较低,一些 PACvesicle 还包含小的囊泡状结构.在蓖麻子,大豆和水稻中也发现类似结构“.PACvesi
6、cle 是如何形成的 ?一般情况下,绝大多数蛋白质在内质网合成后,经过特异性载体分类分选进入特定运输囊泡被运送到高尔基体,接受加 1 二后再被运到各自的基金项目国家自然科学基金(30840002,30970223); 黑龙江省留学归国人员科学基金(LC08C03);中央高校基本科研业务费专项资金(DID9DA02);东北林业大学引进人才科研启动全(015-602042);中国博士后科学基金特别资助 (200902365)和黑龙江省留学人员科技活动项目择优资助(200914ULixinLi).作者简介齐柬男(1984),男,辽宁凌源人,硕士研究生,研究方向:植物种子储藏蛋白质运输.通讯作者,教授
7、.博士,从事细胞分予生物学研究,E.mail:lixinlilgmail.COm收稿日期 2011-03_01图 1 内质网衍生结构Hg.1Derivedstructureofendoplasmicreticulum(ER)目的地,这种蛋白质分选方式叫做受体依赖型运输.而南瓜储藏蛋白质 2s 白蛋白和 1lS 球蛋白的前体在内质网大量合成后聚积形成聚集体(Aggregate),然后出芽形成 PACvesiele.PACvesicle 不经由高尔基体直接把蛋白质转运到蛋白质储藏型液泡中,这种蛋白质运输方式又叫做聚集体形式运输,和上面提到的受体依赖型运输截然不同.一些从内质网借助其他运输囊泡逃逸到
8、达高尔基体的蛋白质前体被循环于高尔基体和 PACvesicle 之间的储藏蛋白质受体 Pv72回收到 PACvesicle,然后一起运到液泡“.在转基因植物中,PACvesicle 可以通过外源蛋白的大量表达诱导形成.如在拟南芥中,2S 白蛋白亚基和 PAT(Phosphinothrieinacetyltransferase)的嵌合蛋白质的过表达诱导形成大量 PACvesicle.除了发育中的种子,在营养器官如莲座叶,胚轴和根中都能观察到诱导形成的 PACvesicle15.在一种转基因大豆种子中,Bconglycinin 的仅和亚基的表达通过基因沉默受到抑制,其种子中总油类和蛋白质的含量与亲
9、本相似,8 一 conglycinin 含量的减少由大豆球蛋白(11S 储藏蛋白质)蓄积量的增加所弥补.在转基因种子中检测到有大豆球蛋白前体的大量蓄积,导致一种内质网衍生的囊泡结构发生,这种结构类似于南瓜种子中的 PAC小泡,其膜结构来源于内质网,并且不含有蛋白质储藏型液泡膜特异性蛋白一 TIP 此新型蛋白质体的主要组分是大豆球蛋白,此结构中的多肽不含有聚糖类复合物,表明6302 安徽农业科学 2011 生此囊泡具有前高尔基体和非液泡性质.在种子开始发育得到成熟及萌发过程中均存在这种新型结构.此研究为通过基因工程诱导形成能够储存蛋白质的新型细胞结构以生产新型蛋白质或者提高某种蛋白质含量提供理论
10、基础.1.2Proteinbody 种子储藏蛋白质储存在 2 种不同的细胞结构中,一种是蛋白体(Proteinbody,PB),另一种是蛋白质储藏型液泡(Proteinstoragevacuole,PSV).PB 主要是储存于玉米和水稻等谷类作物的醇溶蛋白.在水稻胚乳细胞中,2 种主要储藏蛋白质醇溶蛋白(Prolamine) 和谷蛋白 (Glutelin)的 mRNA 形成后沿着细胞骨架分别运送到蛋白体形成区域(PB-ER)和其他层板状区域(CER),ProlaminemRNA的翻译产物转运到内质网腔内,在 BiP 等分子伴侣的协助下进行装配,聚积产生蛋白质聚集体,然后直接出芽形成PB.在玉米
11、和水稻胚乳中,PB 与内质网并未完全脱离 ,电镜下观察玉米胚乳细胞可发现内质网膜的末端与 PB 连接.在转基因水稻中,醇溶蛋白和绿色荧光蛋白(GFP)的融合蛋白在胚乳细胞中形成 PB,在叶片和根中形成类似于 PB 的高电子密度结构 .在小麦中,PB 直接从内质网出芽形成独立的结构,最初形成的 PB 直径约为 1 2m,随后 PB 体积增大并相互融合 ,最终在细胞中形成蛋白质基质一.1.3MAG2bodyMAG2body 是李立新等在蛋白质细胞内转运异常的拟南芥 mag2 突变体种子细胞中发现的新型结构,含有储藏蛋白质前体和内质网分子伴侣(免疫球蛋白重链结合蛋白(Immunoglobulinhe
12、avychainbindingprotein,BiP)和蛋白二硫键异构酶(Proteindisulfideisomerase,PD1).在 mag2 突变体种子细胞中,由于蛋白质运输受阻,储藏蛋白质前体和分子伴侣无法有效运离内质网而滞留在内质网腔内聚积形成聚集体,最终形成 MAG2body.MAG2bodv 具有高电子密度的核心部分和低电子密度的基质部分.核心部分由 2s 白蛋白的前体组成,基质部分包含 12S 球蛋白前体以及 BiP 和 PDI.这是首次发现 2S 白蛋白和 12S 球蛋白前体分别定位而非混合在一起.但是,拟南芥储藏蛋白质从内质网运输到液泡的机制还不清楚.2 水解酶的储存和运
13、输结构2.1ERbodyERbody 是 Matsushima 等(2002)在表达带有内质网驻留信号一 HDEL 的 GFP 的转基因植物细胞中发现的,在野生型植物细胞中也观察到同样结构.ERbody 是纺锤形,体积较大的结构,长约 10m,宽约 1txm,主要成分是PYK10,一种 C 端带有内质网驻留信号一 KDEL 的葡萄糖苷酶.此外,ERbody 还含有 RD21 和 VPE2 种受胁迫诱导的蛋白水解酶-26.PYK10 属于 p 一葡萄糖苷酶(BGlucosi dase),在有伤害,胁迫或病原体侵染时,能与基质发生反应生成毒素,起到防御作用.那么,PYKIO 是如何浓缩到 ERbo
14、dy 的?一种可能性是类似 PB 的形成机制,PYKIOmRNA被运送到内质网的特定区域促使 PYK10 集中大量合成并形成 ERbody,ERbody 膜上有许多核糖体附着现象支持这个假说;另一种可能性是大量的 PYK10 在内质网腔内形成聚集体,促进 ERbody 的形成.野生型植物中,ERbody 只能在幼苗的子叶,胚轴和根细胞中观察到,这些组织细胞对周围环境胁迫很敏感,暗示 ERbody 的形成和环境胁迫间的联系.另外,当莲座叶受到损伤(如机械伤害,虫噬等),在伤口周围会出现大量 ERbody.外源茉莉酸甲酯等与防御有关的化学物质也能诱导 ERbody 的形成-26.以上事例说明ERb
15、ody 和植物的防御功能有密切关系.然而,在子叶受机械损伤的伤口附近形成的 ERbody 含有的不是 PYKIO 而是另一种葡萄糖苷酶一 BGLU18,说明组成型和诱导型 ERbody的内含物是不同的,这 2 种 ERbody 可能在植物防御反应中发挥不同的功能.ERbody 的可诱导性体现了内质网在响应内,外界环境胁迫的灵活性.那么,调控 ERbody 形成的分子机制有哪些? 第 1 个鉴定出来的基因是 NAIl.NAIl是含有 basichelixloop.helix(b-HLH)结构域的转录因子,nail 一 1 突变体幼苗几乎没有 ERbody,也没有 PYK10 蛋白,在突变体细胞内
16、瞬时表达 NAIl 基因能诱导 ERbody 的形成,说明 NAIl 基因与 ERbody 的形成有密切关系.另外,nail.1突变体中,与 PYK10 共同形成复合体的因子的编码基因At3g16420 的表达下调.这些说明 NAIl 在 At3g16420 基因的上游发挥作用.另一个调控 ERbody 形成的因子是NAI2,NAI2 蛋白定位于 ERbody.当其缺失时,ERboay 变长而且数目减少.nai2 突变体中,PYKIOmRNA 的量没有变化,但是蛋白质的量大幅减少,而且不是聚积在 ERbody 中.而是弥散分布在整个内质网.这些说明 NM2 对 PYKIO 的分布和 ERbod
17、y 的形成起关键作用.NAIl 基因调控 NAI2 基因的表达,但是反过来,NAI2 基因不影响 NAIl 基因的表达.2.2KDELvesicle 大多数可溶性内质网驻留蛋白 C 末端含有 KDEL 或 HDEL4 肽序列,此序列叫做内质网驻留信号.高尔基体上的 ERD2.KDEL 受体能识别这种信号,把从内质网逸出的驻留蛋白送回内质网.H/KDEL 系统在哺乳动物,植物和酵母中高度保守.高等植物中含有其特有的 Papain 型水解酶,这种水解酶的 C 末端含有 KDEL信号-41j.Papain 型水解酶参与种子储藏蛋白质的降解作用.在萌发的豇豆(Vignamungo) 幼苗子叶中,一种
18、C末端含有 KDEL 信号的名为 SH-EP(Sulfhydrylendopeptidase)的 Papin 型水解酶一半胱氨酸蛋白酶 (Cysproteinase)与蛋白质储藏型液泡中储藏蛋白质的降解作用有关删.SHEP 具有较强的水解酶活性和宽广的底物特异性.删.通过全长 SH-EP 及其 KDEL 序列缺失片段在昆虫 Sf-9 细胞中进行表达试验发现,SHEP 的 KDEL 信号能够使 SHEP 作为一种暂时性酶原储存在内质网中.Toyooka 等(2000)利用 SHEP 抗体对 mungo 幼苗子叶细胞进行了免疫细胞化学分析发现,SH.EP 前体分子积累在内质网的边缘或中间区域形成
19、KDEL 小泡(KDELvesicle,KV).KV 的直径在 200500nm 之间,从内质网出芽后不经由高尔基体直接到达液泡.在拟南芥和烟草 Brightyellow2(BY2)培养细胞中表达全长 SH.EP 和 KDEL 缺失片段(SHEPKDEL),发现在全长SH.EP 表达的细胞中,SH.EP 进入类似 KV 的运输囊泡然后运输到液泡,相反在表达 SHEP_KDEL 的细胞中不形成 KV,并且 KDEL 缺失片段被分泌到细胞外.因此,具 KDEL 信号的半胱氨酸蛋白酶的 KDEL 序列与 KV 的形成及通过 KV 进行的有效地液泡运输相关.39 卷 11 期齐柬男等植物细胞内质网衍生
20、结构的多样性 63032.3Ricinosomes1970 年 2 个研究小组存超显微结构及细胞化学分析过程中发现,在蓖麻籽胚乳中含有一种类似微体(microbody-like)的结构 ,这种组织比乙醛酸循环体 (Glyoxvsomes)略大,可能来源于内质网,因此称之为“dilatedcisternae“(Vigil,1970),又因为它是蓖麻籽所特有的结构,所以义称为“RicinosoiYle“Ricinosomes 为圆形,直径在 0.9wn左右,单层膜结构,膜表面布满 r 核糖体,主要成分是 Papain型半胱氨酸内切酶 cysEP.C.Gietl 等“从萌芽的蓖麻籽中纯化得到分子量为
21、 35KD 的 CysEP,这种内切酶的成熟型在体外可将乙醛酸苹果酸脱氢酶前体蛋白(pregMDH) 加工成为成熟型.蛋白序列分析显示这种 CysEP 的 N 末端及内部氨基酸序列与发芽的豇豆(Viglulmungo)子叶,野豌豆属 (Viciasativa)籽苗,成熟中的菜豆(Pllseolusvulgaris) 豆荚中成熟的papaintype 半胱氨酸内切酶具有很高的同源性.这些内切酶在内质网中合成时其 N 末端具有前前序列(pre prosequence),绝大多数 C 末端具有内质网驻留信号一 KDEI 序列.在蓖麻(Ricinuscommunis) 种子中,油脂和蛋白质储存在子叶周
22、围的胚乳中,萌芽时这些储存物被运输到子叶中.转运结束后,胚乳组织开始发生程序性细胞死亡(PCD),萎缩并脱离子叶.在 PCI)过程中大量 Rieinosomes 从 ER 出芽,说明 CysEP 在 PCD 发挥重要作用=.目前已经在一些衰老的组织中找到这种具有 KDEL 尾的半胱氨酸内切酶的同源物,主要定位于枯萎的百合翼瓣和退化的种皮 Ricinosomes 中.在拟南芥中已经确认了 3 种具 KDEL 尾的半胱氨酸内切酶的基因:第 1 种在老化的胚珠中表达,第 2 种存脉管中表达 ,第 3种主要是存成熟的果实中表达.这些基因为植物 PCD 研究开辟了新的道路.3 其他内质网衍生结构3.1C
23、OPHvesicle 衣被蛋白复合体 II(COPII)介导的从内质网到高尔基体的囊泡运输是大多数真核细胞中的重要囊泡运输方式.大部分的膜及可溶性货物蛋白均富集在 COPII囊泡中,浓度高达 350 倍,充分证明大部分的分泌蛋白通过活跃的分选进入 COPII 囊泡,这种囊泡结构直径约为 5090nrtl:这种选择性募集是通过货物蛋白上的输出信号驱动,大部分跨膜货物蛋白的输lj 信号能够直接与 COPII 衣被亚基相互作月 j.COPI1 介导定向运输 ,其运输过程涉及到许多闪子,如 Rab,SNARE,tetheringfactors,SM 等,其中 Rab 是一种小GTP 水解酶,tethe
24、ringfactor 能够与运输囊泡上的 coat 蛋白相互作用,促进运输囊泡与靶位膜发生最初接触,SNARE 复合体能够促进膜融合过程的发生,而 sM 蛋白在 SNARE 复合体的形成过程中发挥重要的渊节作用.3.2LipidbodyER 也是脂类合成的重要场所脂类作为种子萌发的能量来源,在种子发育过程中发生积累,贮存于油脂体(Lipidbody,LB;植物中也称为 Oilbody,OB)中.油脂体直径通常存 0.52.0m 之间,由磷脂(Phospholipids,PL)单分子层包被,内部是储存脂类(FAG)形成的基质,磷脂单分子层表面附着多种油脂体膜蛋白,如 oleosin等.这些油脂体
25、结构募集一些特定的蛋白质,进而从内质网出芽,在细胞质中以自由形式存在:存植物,动物以及微生物中,油脂体的形成机制具有一些共同的特点:油脂体可能产生于内质网的特定亚结构域(Subdomain)(或原核细胞的质膜),此亚结构域中富含油脂生物合成酶,并且它们的形成以及大小受特定蛋白质组分的渊控.尽管油脂体是一种结构相对简单的细胞器,但是关于其形成及降解的机制目前尚未阐明.油脂体发生并形成于几乎所有生物体的生命周期中,是绝大多数真核生物能量储存和转运的主要来源中性脂类的储存异常会导致多种人类疾病的发生:通过生物技术渊控生物体脂类的储存将对医学和农业的发展有重大意义.对这一领域的进一步探索,将为阐明内质
26、网在除了传统囊泡介导分泌途径的胞内运输方面所具有的新功能提供依据一4 展望ER 足一个能够产生自身所需蛋白质和脂类的亚细胞工厂,高尔基复合体,内含体,前液泡体(Prevacuolarcompartment,PVC),液泡,i 容酶体 ,分泌泡 ,质膜等结构通过囊泡运输过程相连接形成连续的内膜系统.内膜系统的分子机制在植物,动物和酵母具有一些共同特点内质网衍生结构与内膜系统紧密相连.然而,这些衍生结构都是植物特定组织在应答内部和外界信号的过程中受到诱导从而产生的,在植物生长状态下 ER衍生结构的形成具有精密的调节机制.因此,这种调节机制白能是植物所特有的,并且与高等植物的整个生命过程直接相关.尽
27、管这些 ER 衍生结构在结构和功能上各异,存其形成和发育过程中可能具有共同的分子调节机制.通过蛋白质组学对分离的衍生结构进行研究,有利于确认在植物系统中发挥关键作用的分子分离在衍生结构形成过程中发生缺陷的突变体可能也是一种较为有效的方式.例如,通过过表达带有选择性标记酶的 2s 白蛋白亚基诱导产生 PACvesicle 的转基冈拟南芥仍然对各自的抗生素敏感,对此抗生素具有抗性的突变体,其 PACvesicle 形成过程可能发生缺陷.对 nail 突变体进行 DNA 阵列分析还叮以确认 NAIl 基因的下游序列这些因子的确认将为研究高等植物进化过程中产生的 ER 衍生结构提供新的思路和策略参考文
28、献1SP7RGERI.Endo1)lasmicreticulum:StructureandfunctionMGalveston:UniversityofTexasMedicalBranch,20022MMXFIELDF1/,g%STNERD.IntraeellularcholesteroltransporlJ.JClinInvest,2002,110(7):891899.3HARANISHIMUKI,MATSUSHIMAR,SHIMADAT,eta1.,ersityandfonnationofendoplasmiereficulum?derivedeompmmentsinplants.Aret
29、hesecompallnlentsspeciFictoplant(:ells?J.PlantPhysiol,2004,136:3435 一 M394IARKINSBA,HURKMANwJ.SynthesisandDepositionofzeininproteinbodiesofmaizeendospemJ.PlantPhysiol,1978,62:256263.5iJx,IY,ZHANGDZ,eta1.Riceprolanfinproteinbodybiogenesis:ABiPmediatedprocessJ.Science,1993,262:1054105661AuNISHIMUK1,SHIMADT,HATANOK,eta1.Fransportofstorageproteinstoproteil-storagevacuolesismediatedb,largeprecursoraccumulating,esielesJ.PlantCell,1998,10:8Z5836.7JSCHMII)M,SIMPS()ND,IOUSEKF,eta1.Acysteineendopeptidase
