1、ICS 11.100C50WS中 华 人 民 共 和 国 卫 生 行 业 标 准WS/T XXXXXXXXX免疫细胞化学检验及质量保证Immunocytochemistry assay and quality assurance（报批稿）XXXX - XX - XX 发布 XXXX - XX - XX 实施中 华 人 民 共 和 国 国 家 卫 生 和 计 划 生 育 委 员 会 发 布WS/T XXXXXXXXXI前 言本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）MM4-A文件Quality Assurance for Immunocyt
2、ochemistry; Approved Guideline制定。本标准由卫生部临床检验标准专业委员会提出。本标准起草单位：四川大学华西医院、第二军医大学长征医院、福建医科大学附属第一医院。本标准主要起草人：王兰兰、蔡蓓、唐江涛、仲人前、欧启水。WS/T XXXXXXXXXII引 言免疫细胞化学检验目前已在全世界广泛应用，具有较好的临床应用价值。但是由于样本采集、结果分析等方面原因，免疫细胞化学检验结果变异较大，导致实验室间检测结果重复性较差。免疫细胞化学检验应用中应全面了解免疫细胞化学检验的特异性、敏感性、分析重复性和局限性。目前免疫细胞化学检验国内尚缺乏操作标准及对实验室方法的评价标准。本
3、标准旨在通过规范免疫细胞化学检验操作流程等环节保证免疫细胞化学检验结果的有效性和重复性，辅助临床医生诊断和指导治疗。WS/T XXXXXXXXX1免疫细胞化学检验及质量保证1 范围本标准规定免疫细胞化学检验中组织样本采集和处理、免疫细胞化学检验前处理中的注意事项、免疫细胞化学检验、实验室生物安全和检测结果报告等内容。本标准适用于所有开展细胞学和病理样本免疫细胞化学检验的临床和参考实验室。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。WS/T 251-2005 临床实
4、验室安全准则3 术语和定义3.1 免疫细胞化学 immunocytochemistry 将免疫学基本原理与细胞化学技术相结合建立起来的新技术，利用抗体同特定抗原专一结合，检测细胞内某种多肽、蛋白质及膜表面抗原和受体等大分子物质的存在与分布。检测样本包括组织细胞、培养细胞和悬浮细胞等，检测方法分为直接法和间接法，除了传统的免疫组织化学法，还包括单细胞检测的流式细胞分析术。4 组织样本采集及处理4.1 样本采集4.1.1 样本类型常用样本为组织切片和细胞片。常用的组织切片样本源于活检组织和手术切除样本；细胞片样本来源于组织印片、细胞培养片和各种体液、穿刺液的细胞悬液涂片等，这些样本均应根据要求进行
5、采集。（见 4.1.2 和 4.1.3）4.1.2 样本采集注意事项样本采集的重要环节是采集病灶部位的样本组织进行切片分析或细胞涂片, 但 应 避 开 出 血 、 坏 死区 。血液、细菌培养物、脑脊液、体腔渗出液和细胞悬液等均可简单地涂抹在玻片上，脏器（肝、脾、淋巴结等）或尸体病变组织可把切面压印于玻片上制成印片备用。采集的样本应尽快送检，并适当保存，针对冰冻切片应该尽快分析检测，以保证检测的准确性。4.1.3 组织取材的一般原则WS/T XXXXXXXXX24.1.3.1 厚度及大小厚度一般为 0.2cm0.3cm；面积一般为 1cm21.5cm 2，最多不超过 2cm2.4.1.3.2 不
6、同部位取材要求皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成细条，较长时可缠绕为同心圆状制片；骨组织制片前需脱钙处理。4.1.3.3 组织的保存采用锡箔纸包裹所取新鲜组织（锡箔纸大小一般为 7 cm2-8cm2）；冻存时先液氮速冻，后置-70保存。4.2 样本处理及固定4.2.1 样本处理不同分析目的对检测样本有不同的要求，冰冻切片和石蜡切片是免疫细胞化学检验最常用的制片方法和样本处理方式。具体处理方法如下：a) 冰冻切片是最大限度保存抗原的首选方法，其操作简便，组织的抗原性保存好，可避免石蜡切片因固定、脱水、浸蜡等对抗原所造成的损失，自发荧光较少，特异荧光强，适用于不稳定的抗原分析，缺点是组织结构欠清晰，
7、不易长期保存。主要用于手术中的快速病理诊断、特殊染色（如苏丹 III 染色）、酶组织化学染色、部分免疫细胞化学染色及原位杂交等。切片厚度一般为 6m 8m。风干后染色，或风干 2h3h 后 4保存一周左右，-20可保存1 月3 月，-70可保存 6 月12 月；b) 石蜡切片是研究形态学的主要制片方法，其操作简便，能切薄片及连续切片，易于大批制作。石蜡切片机有轮转式切片机（常用）和平推式切片机，建议使用一次性刀片，刀片倾角以2030为宜，切片厚度一般为 4m5m。石蜡切片可长期保存，组织细胞的精细结构显现清楚，但对抗原的保存不如冰冻切片，并有组织自发荧光和非特异性荧光，需加酶消化处理；c) 培
8、养细胞：细胞爬片生长达适当密度后，丙酮-20固定 10min20min，或用多聚赖氨酸处理，再进行免疫染色。 4.2.2 样本固定良好的样本固定是可靠的免疫细胞化学检验结果的重要保证。样本固定应根据样本性质免疫细胞化学反应类型选择适当的固定剂。蛋白质类抗原，可用乙醇或甲醇固定。固定的乙醇浓度宜为80%95%，但核染色不良，不利于染色体的固定，高浓度酒精固定组织硬化显著，组织形态不好；微生物抗原可用丙酮或三氯化碳固定；若需除去病毒的蛋白质外壳，可使用胰蛋白酶；多糖类抗原用 10% 福尔马林固定或以微火加热固定；若有粘液物质存在，应用透明质酸酶等处理除去；类脂质丰富的组织进行蛋白、多糖抗原检测时，
9、需用有机溶剂（乙醚、丙酮等）处理除去类脂。4.3 样本固定后处理4.3.1 抗原修复WS/T XXXXXXXXX34.3.1.1 样本固定过程中可致组织中某些抗原决定簇发生遮蔽、致使抗原信号减弱或消失。此时必须采用抗原修复步骤以保证检测结果的有效性。不同的抗原需采取不同的修复方法，常用的抗原修复方法如下：a) 酶消化法：无花果蛋白酶为轻度消化酶；胰蛋白酶为中度消化酶；胃蛋白酶为强消化酶。胰蛋白酶：一般使用浓度为 0.050.1，消化时间为 37，10min40min，主要用于细胞内抗原的显示； 胃蛋白酶：一般使用浓度为 0.1%0.4，消化时间为 37,30min180min，主要用于细胞间质
10、抗原的显示；b) 盐酸水解法：操作中应注意掌握盐酸浓度、水解温度及水解时间，以最大程度暴露抗原而又不破坏抗原性为目的；c) 微波加热法：将石蜡切片置于缓冲液中，凭借微波辐射产生的高热效应及高速分子运动能量解开交联蛋白，暴露被掩盖的抗原决定簇；d) 高温高压法：利用加热暴露抗原，经济简单，适用于大批切片的加热处理；e) 煮沸法：利用热效应恢复抗原性。4.3.1.2 实际操作中，不同的方法适用于不同类别抗原的修复，需通过预实验摸索适当的抗原修复方法及实验条件，如温度、酶浓度等。不同抗原修复的推荐方法见表 1。表 1 抗原修复的推荐方法抗原类型 修复方式 修复温度 修复时间 修复液包膜抗原 微波加热
11、法 95100 加热3min，保温15min柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0胞质抗原 微波加热法 9095 加热2min，保温8min 柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0胞核抗原 高温高压法 加热至喷气 2min 柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0特殊类型抗原 微波加热法或高温高压法同微波加热法或高温高压法同微波加热法或高温高压法柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0或EDTA, pH 8.0或9.04.3.2 内源性物质的处理样本的内源性物质,如内源性过氧化物酶等，可以干扰不同检测原理下免疫细胞化学检验结果，因此根据检验目的，应采用适当的样本处理和加工方法以消除干扰。内源性酶或生物素丰富的组织，如肝脏、肾脏等，需考虑
12、检测前的样本处理过程。内源性物质的处理方法如下：a) 灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24mg/mL）加入底物液中，保持 pH 值在7.68.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶； b) 灭活内源性过氧化物酶：石蜡切片：0.3%0.5%甲醇过氧化氢液，室温处理 30min；冰冻切片：3%双氧水处理 5min；内源性过氧化酶含量过高的骨髓片和血片最好使用碱性磷酸酶作显色系统； c) 阻断内源性生物素干扰：消除内源性生物素可先滴加链霉亲合素，以饱和内源性生物素，使之不再有剩余的结合位点。 具体方法：在链霉亲合素-生物素-过氧化物酶复合物染色法（ABC）染色前将切片浸于 24mg/mL 卵白
13、素液中处理 15min，水洗后再以饱和生物素液处理WS/T XXXXXXXXX45min；使用链霉亲合素制备的 ABC 复合物，由于链霉亲合素等电点偏碱，不与内源性生物素结合。4.4 样本固定和处理中常见问题免疫细胞化学检验前处理中常见问题及解决方法如下：a) 样本的固定方式不当或固定时温度过高，都可影响所检测抗原的数量和质量；b) 不适当的抗原修复方式所致的检测结果假阴性，建议参照生产厂家的说明和样本的具体情况进行选择；c) 封 闭 血 清 选 择 使 用 不 当 ， 可 导 致 高 非 特 异 性 染 色 所 致 强 背 景 。 建 议 使 用 二 抗 动 物 的 非 免 疫血 清 或 血
14、 清 白 蛋 白 、 5%脱 脂 奶 粉 封 闭 吸 附 位 点 。5 免疫细胞化学检验样本处理中的注意事项5.1 抗原修复注意事项5.1.1 严格控制影响抗原修复的因素，如加热的温度和时间、加热处理时浸泡切片的抗原修复溶液的pH 值等。但并不必对每一种抗原检测都进行抗原修复。绝大多数胞质抗原不需作任何修复处理也可获得较稳定的染色结果，采用微波加热法修复可使结果显色和检测敏感性增强。胞膜抗原修复宜使用微波加热法，所用时间和温度比胞质抗原修复更长、更高。胞核抗原分析时建议应用高温高压法修复。5.1.2 各类抗原修复法的修复能力由高到低依次是:高温高压法高温煮沸法微波加热法超声法酶消化法。5.1.
15、3 高温高压法是一个广谱抗原修复法，但对于神经系统相关抗原和丙肝抗原等修复不理想，如修复时间不佳可造成假阳性或假阴性。对于操作者而言，每购进一批新抗体都要进行对照实验，试剂说明书中标注的抗原修复法并不完全适应于每一个实验室，工作中需要实验室进行反复对照分析后建立本实验室各种抗原的最佳修复方法。5.1.4 抗原修复法的选择原则如下：a) 抗体不熟悉时可先不作任何修复，直接进行免疫细胞化学检验的常规操作，与阳性对照比较，如能达到相似或相近的效果则说明无需进行修复，若为假阴性则先进行化学性抗原修复；b) 化学性修复后，若仍为假阴性则继续进行物理/化学性修复；c) 在物理/化学性修复中推荐使用高温高压
16、法。该法抗原修复效果明显，假阴性率低，定位更准确。5.1.5 修复介质的选择，推荐柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)作为免疫细胞化学检验的首选介质，染色背景清晰，易于保存，不易引起组织块脱落的特点。但是，少数情况，如 CD3、P53 等抗原分析时柠檬酸盐缓冲液并不理想，宜使用 EDTA 液或 Tris 液。5.2 切片粘附性切片的粘附性直接影响着免疫细胞化学检验的结果。分析过程中，抗原片脱落可导致检测失败。为增强切片的粘附性，通常采用粘附剂处理载玻片。增强切片粘附性的要点：WS/T XXXXXXXXX5a) 新载玻片的处理：洗液浸泡 12h24h，自来水冲洗后用蒸馏水清洗，绸布擦干或烤箱烤干。清洁的
17、载玻片再用粘附剂处理；b) 常用的粘附剂如下：1) 3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane， APES）：现用现配。纯丙酮或甲醇配制 2%APES(v/v)；洗净的玻片浸于此液中 20s30s；取出稍停片刻，再放入纯丙酮酮溶液洗去未结合的 APES，置通风橱中晾干或 60烤箱烤干备用。 2) 多聚赖氨酸(Polv-L-Lysine)：清洁玻片浸于 100mg/mL(10%w/v)的多聚赖氨酸溶液中(去离子水稀释)，37C 放置 30min；60烤箱烘烤 1h 或室温过夜干燥备用。3) 铬明胶溶液 ：铬明矾(chrome alum) 0.25g、明胶(g
18、elatine) 2.5g 和蒸馏水 500mL。铬明胶溶液制备：铬明矾溶解于 40少量蒸馏水，再加入明胶及剩余蒸馏水，70 水浴中使明胶溶化，搅拌均匀后，即可使用。铬明胶溶液稍加溶化后，将切片浸泡2min3min，过夜晾干备用。6 免疫细胞化学检验6.1 抗体6.1.1 抗体的选择建议使用商品化试剂，并应注意抗体系统。应注意选择具有高度特异和稳定的优质抗体，根据需要决定采用单克隆或多克隆抗体。抗体选择原则如下：a) 单克隆抗体和多克隆抗体的选择：单克隆抗体特异性强，但敏感性不够高,不适合蛋白表达低的组织；多克隆抗体检测范围广，灵敏度高，价格便宜，但特异性不如单克隆抗体，有时会造成抗体的交叉反
19、应；b) 种属选择：一定要抗样本来源的属性，一般多为兔，鼠来源；c) 适合的实验类型和切片类型：很多商家的抗体都注明使用实验类型免疫细胞化学（IHC）、免疫荧光（IF）、流式细胞术（FC）、免疫印迹技术（WB）、酶联免疫吸附分析法（ELISA）等，甚至详细到切片的类型。 6.1.2 抗体的稀释操作前需进行预实验，摸索抗体的最佳稀释度，以达到最小背景染色下的最强特异性染色。6.1.3 抗体的保存根据厂家提供的保存条件分装密封保存；避免抗体污染；保存时标记注明（批号、名称、效价、体积、分装时间）；避免反复冻融致抗体效价降低。6.1.4 标记二抗的选择选择标记二抗主要是针对二抗结合的标记物进行选择，
20、如荧光标记分析时荧光素的选择；酶标记分析显色系统包括碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶；链霉亲合素-生物素放大系统。根据分析靶抗原的具WS/T XXXXXXXXX6体要求选择不同的显色体系。如针对弱表达抗原宜选择链霉亲合素-生物素放大系统；针对骨髓片及血片样本宜采用碱性磷酸酶反应体系。6.2 免疫细胞化学检验操作流程宜以检测试剂厂家说明书为基础，进行本实验室预实验，最后根据摸索的最佳检测条件和流程进行操作。同时建立本实验室相应检测项目的检测流程的规范化文件。免疫细胞化学检验中对照极其重要，应设立对照，主要包括阳性对照、阴性对照和空白对照，最好设立自身对照；应保证“阳性结果有阴性对照，阴性结果有阳性对照
21、” 。6.3 免疫细胞化学检验的质量控制6.3.1 检测试剂的质量控制抗体质量是免疫细胞化学检验成功的关键。使用前应了解第一抗体（即特异性抗体）和第二抗体（桥联抗体）的特异性和敏感性；通过预实验决定抗体的最佳稀释度；在已知阳性和阴性的样本上观察实验结果的符合情况。此外，试剂的质量控制还包括确定抗体合适的稀释剂、孵育温度和时间、试剂的复溶和有效性等。6.3.2 检测样本的质量控制采用适当方法采集、运送、处理和固定样本，并合理保存样本。荧光免疫分析样本的保存时间相对较短，4下一般细菌涂片或器官组织切片经固定后可保存一个月以上，病毒和某些组织抗原样本需在-20以下保存。免疫细胞化学检验的质量控制为定
22、性质控，必须包括阴性、阳性或自身组织对照三种类型。质控品的设置有助于监控样本制备、操作过程、染色步骤、试剂质量等问题引起的误差。6.3.3 操作过程质量控制检测人员需严格按照标准化操作步骤进行，关注检测结果的变化情况。6.3.4 实验设备的质量控制需定期对相关设备和器具进行校准。操作相关工具如吸管、试管、加样枪等需进行消毒，以减少对抗体污染的机会。6.4 显色（结果观察）方法根据显色方式不同可分为荧光免疫染色、酶免疫染色多采用辣根过氧化物酶（HRP）、金属离子(如胶体金技术)、同位素等，可通过显色对待检抗原进行定位、定性或半定量分析。6.5 注意事项免疫细胞化学检验由于操作步骤较多，因此需对多
23、个操作环节进行规范。分析过程中需注意的重要事项：WS/T XXXXXXXXX7a) 样本应新鲜，宜在 2h 以内进行固定，超过 2h，组织将有不同程度的自溶，其抗原或变性消失，或严重弥散而影响检测结果；b) 样本采集时除取病灶或含待检抗原部位外，宜取病灶与正常交界处，即所取组织切片中同时应有抗原阳性和阴性区，以形成自身对照；c) 取材时应使用锋利的刀刃，镊取组织动作要轻，避免组织挤压，防止由组织受挤压致边缘细胞形态改变和非特异着色的增加；经窥镜直接钳取的组织往往有过度挤压，观察结果时应慎重考虑；d) 分析过程中防止切片干燥，避免非特异性显色增强；e) 醛类固定剂固定的组织具有自发荧光，不宜做免
24、疫荧光染色。避免方法：将伊文斯兰（Evas blue）加入免疫荧光染色稀释液中，自发荧光可变为红色，可与特异性荧光区别；f) 商品化试剂在运输和贮存过程中抗体失效，染色条件和操作失败是免疫细胞化学检验失败的常见原因；g) 非特异性染色的主要原因：组织固定不良、血浆浸染、坏死、切片打胶、切片刀痕、静电吸引、免疫球蛋白与 Fc 段受体结合、第二抗体与组织中免疫球蛋白结合、组织中残存醛基与免疫球蛋白结合等；h) 排除内源性酶和色素所致的干扰。去除组织中福尔马林颗粒：饱和的酒精/苦味酸溶液处理切片，再用 1%NaOH,7%甲醇处理。鉴别黑色素采用 azure B 复染细胞核。6.6 染色过程中常见问题
25、及处理方法6.6.1 非特异性背景染色过强的常见原因及解决方法见表 2。表 2 非特异性背景过强的常见原因及解决方法常见原因 解决方法洗涤不充分 增加洗涤次数和洗涤时间反应过程中切片干燥 防止反应过程中切片干燥切片制作中出现组织折叠 避免折叠处观察结果组织中内源性过氧化物酶未灭活 使用新鲜3%H 2O2灭活组织中内源性生物素未封闭 可采用饱和法阻断内源性生物素干扰封闭时间过短 延长血清封闭时间样本未及时固定 采集新鲜样本，一般2h内固定切片粘附剂过厚 重新配置粘附剂涂片一抗问题：浓度过高多克隆抗体抗体与组织的内源性蛋白存在交叉反应降低一抗浓度或缩短一抗孵育时间使用单克隆抗体更换抗体试剂显色时间
26、过长 缩短显色时间，可显微镜下观察判断免疫球蛋白与Fc受体结合 用与二抗相同来源的正常血清在使用一抗前封闭切片；使用不含Fc段的F(ab)2抗体。第二抗体与组织中免疫球蛋白结合 用与待测组织相同的5%正常血清稀释二抗静电吸引 尽量稀释第一抗体；灭活补体；增加抗体稀释液的离子强度，如含2.5% NaCl的缓冲液，或0.05 mol/L的TBS；使用去垢剂，如Triton-100处理切片WS/T XXXXXXXXX86.6.2 显色阴性常见原因及解决方法见表 3。表 3 显色阴性的常见原因及解决方法常见原因 解决方法操作错误 重新试验，设立阴性、阳性对照待检组织中抗原问题：无分析抗原抗原修复不全血
27、清封闭时间过长胞内或核内抗原检测时，细胞通透不全设立阳性对照，证实实验结果改进抗原修复方法适当缩短血清封闭时间进行更充分的细胞破膜作用抗体质量问题 二抗种属与一抗种属不匹配显色问题 使用与标记抗体匹配的显色系统；适当延长显色时间相应检测试剂活性降低 不同批号试剂不能混用，过期试剂不能使用7 实验室生物安全实验室生物安全根据WS/T 251-2005进行，以个人生物安全防护等作为实验室安全防护重要内容。由于免疫细胞化学检验样本的传染性不可预知，因此所有病人样本应视为生物危险样本，按全面型预防措施处理。同时实验室工作人员不仅需要技术培训还应参加过全面的生物安全培训。8 检测结果报告8.1 报告模式
28、免疫细胞化学检验为定性分析，结果报告模式应采用：检测抗原类型，组织定位，-或+，+，+，分布形式（弥散，局部或膜表面，胞质内或核内分布）。8.2 样本特征结果报告中对分析样本质量进行描述，尤其是对于不理想样本需要说明，以供临床医生分析结果时参考。8.3 结果报告及分析8.3.1 结果可靠性保证：结果应基于阳性对照、阴性对照和空白对照等各类对照正确的前提下进行。WS/T XXXXXXXXX98.3.2 定性分析的结果报告，需描述检测抗原的组织定位，及其表达情况，并且对样本取材和固定、制作给予描述，便于临床医生综合分析。对于部分阳性显色样本，临床医生需要可进一步给出定量结果。免疫细胞化学检验的反应
29、强度不仅取决于抗原的多少，还与染色反应的放大程度，显色反应时间和温度等相关。不同批次的染色反应间进行定量比较，可信度很小，一般只能进行半定量的分析。在半定量分析时，应以切片中的已知阳性细胞为参照物，强度一般以弱阳性（）、阳性（+）和强阳性（+）记录。阳性反应分布常用记录方式是以阳性细胞占全部细胞的百分率进行半定量记录，如阳性细胞在 25%以下为可疑（），25%50%为+，50%75%为+，75%以上为+。注：定量分析的结果判断方法：a) 人工法：选择每个样本中 10 个非重叠视野，计算每个视野中的阳性细胞与总细胞数的百分比，取平均数，连续观察和计算至少二个条件相同的样本，数据经统计学处理后以柱
30、形图表示；b) 计算机法：图像分析系统检测阳性结果。 WS/T XXXXXXXXX10参 考 文 献1 王兰兰,吴健民. 临床免疫学与检验（第4版）M. 北京：人民卫生出版社，20072 王伯沄. 病理学技术 M. 北京:人民出版社, 20003. 陈尚采,孙曼罗.临床病理组织与免疫组化诊断学M. 上海：上海医科大学出版社,19994 纪小龙,张 雷. 诊断免疫组织化学（第三版）M. 北京：人民军医出版社,20115 Quality Assurance for Immunocytochemistry; Approved Guideline. CLSI document MM4-A. 1999_
