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人巨细胞病毒潜伏激活感染诊断的进展课件.ppt

上传人:微传9988 文档编号:2430728 上传时间:2018-09-15 格式:PPT 页数:68 大小:8.36MB
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资源描述

1、1,免疫组织化学技术,IHCTImmunohistochemistry technique 定义:在组织细胞原位,通过抗原/抗体反应和组织化学的呈色反应,借助可见的标志物,对被检测抗原/抗体进行定性、定位和定量检测的免疫学测定技术。 特点:结免疫学反应特异性和组织化学可见性为一体;借助先为显微镜放大,于细胞或亚细胞水平测定抗原/抗体。,2,免疫组织化学技术,类型:酶免疫组化技术荧光免疫组化技术免疫电镜技术亲和免疫组化技术(标记物等的不同)实例:,3,4,5,一、免疫组化技术介绍,(一)标本制作 (二)抗体的选择 (三)抗原/抗体反应 (四)改善标本的通透性 (五)对照项的设立 (六)检测结果的

2、判断,6,(一)标本制作,标本 指固定在玻片上用作为抗原的,如组织、细胞或微生物。,7,标本的类型 组织切片、印片、涂片。,1.印片法: 优点:操作简单,抗原保存好 缺点:细胞厚薄不均,IHC染色易引起背 景染色。,8,2.组织切片,组织切片-冷冻切片/石蜡切片介绍: 特点:组织新鲜、速冻,恒温冷冻切片机片厚510m,-20保存;后者只要求固定的标本,经脱水+浸蜡包埋常温切片机,片厚23m优点: 前者抗原丢失少,结构保证完好;后者片薄观察结构清晰,宜连续性可作回顾性研究。缺点: 前者细胞清晰度差,现用难保留;后者抗原量少,易出现非特异着色,需前处理。,9,1).切片前的准备工作 (1)载玻片的

3、清洁:市售载玻片需经清洁液泡24h,流水冲洗,系列乙醇浸泡,凉干涂胶。,10,(2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸(分子量300KD):0.5%浓度。 APES试剂(3-氨基、丙基三氧基硅烷):干净载玻片丙酮5min APES(1ml+50ml丙酮):用镊子夹住浸入APES试剂13次纯丙酮洗二次干燥玻片用铝箔包好,室温或4保存备用。,11,切片要求及注意事项: (1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。 (2)5260烤片18h。 (3)切片厚24m。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在4保存数年(石蜡切片),12,标本的固定,标本固定需达到目的:细胞内蛋白凝固终止胞内酶活性保持细胞固有

4、态除干扰性类脂等 理想固定剂:能快速固定细胞抗原防止抗原物质扩散固定后抗原的特性不改变 例:10%中性福尔马林液、丙酮、乙醇,13,标本的保存(温度、时间),1.冷冻保存: 2.新鲜组织经适当固定后,装入冻存管 中,-80冻存。 3.蜡块的保存 4.活细胞的保存 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上,9孔板上的细胞可经固定后-80保存备用,大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。,14,标本的预处理(目的、注意点),为什么要进行酶消化和抗原修复? 醛键形成 羧甲基形成 甲醛使蛋白质发生凝固,自身和之间会发生交联,交联时会使蛋白质的四级和三级结构的折叠方向发生改变,使蛋白质苯环结构上的抗原决定簇发生改变

5、,而影响检测。,15,抗原修复(Antigen Retrieval;AR),1 酶消化 (1)原理: 1)去除覆盖于抗原决定簇表面的杂蛋白 2)断交联(2)蛋白酶的种类,16,胰蛋白酶 0.05%0.1胰蛋白酶加入等量的氯化钙,用0.1N NaoH调pH至7.8。消化时间37 30min。胃蛋白酶 0.4%胃蛋白酶,用0.1N HCI稀释,消化时间37 30180min。 蛋白酶K 20g/ml,用pH8.0 0.5M Tris-HCI配制,消化时间37 2040min。链酶蛋白酶 0.1%,用pH 7.4,0.5M Tris-Hcl稀释,消化时间37 14h。 无花果蛋白酶 0.1%浓度,用

6、0.2M pH7.4 PBS稀释,消化时间37 3060min。,17,(二)抗体的选择,第一抗体(一抗):高特异性、高效价、多克隆。高特异性针对性强,靶的明朗高效价稳定性好,反应时间长;适宜稀释可减少干扰。多克隆(动物免疫血清) 针对多为点,易检出。,18,市售抗体的种类某些抗体既有多克隆抗体也有单克隆抗体,如角蛋白,一些抗原只有多克隆抗体,如-胰蛋白酶 有些抗体的抗原来自动物,利用动物与人抗原之间的共同抗原性使该种抗体能应用于人的检测。 近年来,市售单克隆抗体除小鼠源性外,还有兔源性,19,标记抗体,在抗体上用化学方法联接某种标记物,目的是使抗原抗体的结合能用肉眼观察到 标记物种类:荧光素

7、:异硫氰酸荧光素或罗丹明酶:辣根过氧化酶,硷性磷酸酶金属离子:胶体金颗粒 标记的方法:化学性结合将降低抗体效价及标记物的活性,从而使染色敏感性降低,20,抗体的保存 商品化一抗或自制一抗均需加入防腐剂,在4中保存一年其质量不会有太多的改变,如一次购置量大,可10l/支分装,标上号,-40保存备用。 抗体的配制,21,抗体最佳稀释度的测定 直接测定法,一抗稀释度 特异性染色 非特异性染色1:50 + +1:100 + +1:200 + +1:400 + +1:500 + ()阴性对照 () (),22,(三)抗原/抗体反应(温育),保证抗原/抗体反应有效进行的关键。 温度:37(60min)/4

8、(过夜)/微波炉(5min) 湿度:湿盒 避光:,23,(四)改善标本的通透性,通透性:指与大分子抗体反应时,其通过细胞膜的能力。 通过表面去垢剂,如NP-40、TritonX-100使得细胞膜的通透性增强,或通过反复冻-融操作 通透性处理的方式(试剂、浓度、时间)与标本固定方法相关。,24,(五)对照项的设立,设对照的意义:为排除各种可能干扰因素的影响,正确评估检测结果。 阳性对照:选已知某抗原阳性的切片等作同步检测操作,结果必须显示应当出现的阳性表现。 阴性对照:1、空白对照2、替代试验3、吸收试验,25,(六)检测结果的判断,阳性结果的定位明确,如细胞核(病毒)?细胞膜(受体)?细胞浆(

9、表达蛋白)? 阳性结果的分布规律,特异性着色局限且有规律;非特异着色无规律、无界限,定位不准确。 阳性结果的强度,26,27,二、酶免疫组织化学技术,(一)酶标记抗体免疫组化染色法 1、直接染色法 (一步法) 2、间接染色法(二步法) (二)非标记抗体酶免疫组化染色法 1、酶桥联法 2、过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法 3、双桥PAP法 4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP),28,二、酶免疫组织化学技术,酶标记抗体免疫组化染色法:指将酶通过交联剂共价连接在抗体分子上酶标抗体酶标抗体+切片上抗原+底物酶催化底物等显色并沉淀其中,可定性、定位、定量。酶标记抗体为一抗(直接)酶标记抗体为一

10、抗(间接),29,(一)酶标记抗体免疫组化染色法 1、直接染色法 (一步法): 原理:待检标本+酶标记抗体+底物显色 技术要点:除内源性酶、封闭、镜下观察,30,直接法,将荧光、酶、金直接标记在一抗上进行显色,没有联结系统、未用桥抗体。 优点:特异性高、非特异染色轻。 缺点:敏感性低,要求抗体浓度高。每种一抗均需用酶来标记,31,2、间接染色法 (二步法): 原理:待检标本+非标记特异性一抗+酶标记二抗+底物显色 技术要点:同前,Primary Antibody,32,间接法,将标记物标记在桥联抗体上(即二抗、三抗) 一抗往往是兔身上产生的多克隆抗体,其酶标抗体必须是针对兔 优点:敏感性高,只

11、需少数几种动物的二抗就可以和所有一抗相匹配 缺点:特异性差,33,(二)非标记抗体酶免疫组化染色法非标记抗体酶免疫组化染色中,酶不是直接标记在抗体(一抗/二抗),而是经抗酶抗体与酶结合,它既用于抗原检测,也可用于抗体检测。 常见的:1、酶桥联法;2、过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法;3、双桥PAP;4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP),34,1、酶桥联法:Ag-Ab1-Ab2-Ab(E),35,2、过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法:,组成: 一抗是针对靶抗原的特异性抗体 二抗是联结抗体,一面联结一抗,另一面联结PAP复合物 三抗是以过氧化物酶为抗原,在与一抗同种动物身上诱发产生的

12、抗体,并与辣根过氧化物酶形成复合物(PAP),36,酶 抗酶抗体复合物,通过免疫反应而不是化学方法,将酶结合到抗体上,形成具酶活性的免疫复合物。如PAP复合物(Peroxidase AntiPeroxidase Complex),PAP复合物属非标记性,保护了酶的活性,比免疫荧光法敏感上千倍。,37,PAP,Primary Antibody,Secondary Antibody,Peroxidase-anti-Peroxidase,38,特点: 未经化学交联不影响抗体和酶的活性 由2个抗酶抗体和3个酶分子,稳定性好 本身不存在游离免疫球蛋白,非特异少 但复合物制备繁琐,39,优点:PAP复合物

13、中含酶更多,且是一种非标记的免疫组化方法,敏感性更高 PAP复合物常来自两种不同的动物(鼠、兔),鼠PAP用于一抗为单克隆抗体的染色,兔PAP多用于一抗为多克隆抗体的染色 可用于福尔马林固定的石蜡切片,40,3、双桥PAP法: PAP的改良呈Ag-Ab1-Ab2-PAP-Ab2-PAP敏感性提高, 操作太复杂。,41,双PAP法,42,4、碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APAAP)与PAP法相似,其用的是碱性磷酸酶 (AP)。AP代HRP-除内源性酶干扰,特异性高成本高(制备过程复杂)。,43,APAAP法,44,三、免疫电镜技术,Immunoelectron microscope(IEM)技术是

14、利用电子显微镜的高分辨力,能够清晰揭示抗原-抗体特异性复合物,呈现高度精确、灵敏且特异的结果。 标记(示踪)物:铁蛋白、胶体金等标记抗体+抗原不溶性复合物,45,免疫电镜成功的关键: 细胞超微结构要求保存完好 细胞或亚细胞结构的抗原位点保持不变 免疫试剂应选择通透性好 标记免疫物与待检抗原结合性好(特异、稳定),46,三、免疫电镜技术(方法),1、铁蛋白标记免疫电镜技术,含铁25%,分子量450KD 核心4个亚基,电子密度高 铁原子的电子散射力大,镜下反差大,47,1、铁蛋白标记免疫电镜技术 原理:铁蛋白标记抗体,保留抗体免疫活性并具高电子密度,与待检抗原结合,在电镜下易见。 技术要点:铁蛋白

15、标记抗体的制备标记方法:A、一步法B、二步法 免疫电镜样本的制备制备法:A、包埋前免疫染色B、包埋后免疫染色,48,免疫电镜样本的制备中包埋前免疫染色: 固定免疫组化染色包埋、切片镜检免疫电镜样本的制备中包埋后免疫染色: 固定包埋、切片免疫组化染色,镜检,49,2、酶标记免疫电镜技术,电镜下酶标记免疫染色图,50,酶标记免疫电镜技术是将电镜高分辨力与酶 免疫技术的高灵敏与特异性相结合 常用酶:水解酶氧化酶(HRP)+ DAB(底物)转化酶 DAB 3、3二氨基联苯胺。易氧化聚合系 列反应后+锇酸高电子密度的锇黑。 技术分类:(用否酶标抗体、何时用?),51,1)酶标记抗体包埋前免疫染色法,酶标

16、记免疫组化染色间接法实验原理示意图,52,2)非酶标记抗体法(PAP法) 不是用酶直接标记的抗体,而是用(酶蛋白:抗酶蛋白抗体)自然结合物; 操作包括包埋前免疫染色/包埋后 复合物分子大,穿透组织细胞能力? 酶反应的产物会发生扩散?,53,3、胶体金标记免疫电镜技术,电镜下胶体金标记免疫染色图,54,各类标记免疫电镜技术优缺点,1、铁蛋白标记免疫电镜技术:分子质量大通透性差,适宜定位膜表面抗原 2、酶标记免疫电镜技术:相对分子质量较小,易透过经处理的细胞膜,但其反应产物会扩散,确切定位? 3、胶体金标记免疫电镜技术:容易结合多种蛋白(抗体等),探针易制备,密度大电镜下易辨认,适宜细胞表面和内步

17、的定位,55,四、亲和组织化学技术,(一)生物素-亲和素技术 (二)葡萄球菌A蛋白的应用 (三)凝集素的应用,56,亲和组织化学(affinity histochemistry):指利用两物质之间具有高度亲和力而相互结合的化学反应。 亲和物质指具有双价或多价结合力。 例:凝集素(lectin)- 糖结合物(gluco-conjugates)葡萄球菌A蛋白(SPA)- IgG生物素(biotin)- 亲和素(avidin) 激素- 受体,57,亲和组织化学(affinity histochemistry); 免疫组织化学(immunohistochemistry)/ 免疫细胞化学(immunoh

18、istochemistry) 区别 前者不是抗原/抗体的免疫反应,是亲和物质间的相互结合。 亲和组织化学引入免疫组织化学,进一步提 高后者的敏感性,利于微量蛋白在细胞水平 的定位与定量。,58,(一)生物素-亲和素技术,59,亲和素生物素复合物 ( Avidin-Biotin Complex ABC ),亲和素有四个生物素分子特异性结合部位,其结合力强,不可逆,还可和辣根过氧化酶或荧光素等结合 亲和素-生物素复合物是一个三维空间的结构,它利用亲和素为中介,一端通过生物素化的抗体联接第一抗体,另一端通过生物素化酶与显色系统相连接,产生多级放大,从而提高此生物反应的敏感性和特异性 AB复合物多用于

19、ABC法的免疫组化中,60,ABC法 (Avidin-Biotin Complex,亲和素-生物素法),61,一抗,二抗,ABC,DAB,ABC,62,ABC与PAP 法的比较,63,LSAB(SP)法 (labelled streptavidin biotin method)标记的链霉亲和素-生物素法,特点:将HRP直接标记于链霉亲和素上 优点: 更快速:空间结构更小 更敏感:链霉亲和素的亲和性更强,更易于到达深部位点 非特异背景更少:链霉亲和素空间结构特殊,不易与高荷电的组织成分(胶原纤维、结缔组织)联结,64,酶标亲和素(Labelled streptavidin),在AB复合物中,酶是

20、标记在生物素上,而后与亲和素合成复合物。在标记的亲和素-生物素方法中是将辣根过氧化酶直接标记在亲和素上,辣根过氧化酶与亲和素间有极强的结合力,因此LSAB法比ABC法更敏感,65,SP,Primary Antibody,Biotinylated Secondary Antibody,Ensyme-conjugated Streptavidin,66,ABC与LSAB(SP)法的比较,67,(二)葡萄球菌A蛋白的应用 SPA(staphyloccal protein A)是金黄色葡萄球菌细胞壁中的一种蛋白成分。分子量42KD单链多肽,pI为5.1,有3个高度相似的Fc段,能与人或多种动物的IgG结合,还能接受多种标记物的标记。 常用酶标记SPA/胶体金标记SPA 功用:天然二抗,用高稀释渡SPA可减少非特异(与IgG亲和力高),反应速度快。,68,(三)凝集素的应用 Lectin(凝集素)是一类从植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的糖蛋白,能自然凝集RBC、成纤维细胞等。 常见物:植物血凝素刀豆素A 大多数Lectin是由非共价键缔结的亚单位聚合体含共价结合的糖分子,对糖分子结合具专一性。 Lectin能被荧光素、酶、胶体金等标记,

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