1、第三章微生物营养,Microbial Nutrition,营养物质：微生物为了生存就必须从环境中吸取各种物质以合成细胞物质、提供能量和调节新陈代谢。这些物质就称为营养物质。,营养的概念：有机体吸取和利用营养物质的过程。,第一节 微生物的营养要求,一、微生物细胞的化学组成 二、营养物质及其生理功能 三、微生物的营养类型,Nutritional Requirements of Microbial Cells,一、 微生物细胞的化学组成,（一）化学元素(chemical element): 大量元素(macroelement):碳、氢、氧、氮、 磷、硫、钾、镁、钙、铁（其中前六种占细菌细胞干重的97
2、%）。 微量元素(trace element): 锌、锰、钠、氯、钼、硒、钴、铜、钨、镍、硼。,微生物细胞中几种主要元素的含量（干重）,（二）元素在细胞内存在形式：,上述元素主要以水、有机物、无机盐的形式存在于细胞中： 1、水 （1）营养细胞含水量高，占细胞总重的70%90%酵母70%80% 细菌70%85% 霉菌85%90%（2）细菌芽孢、霉菌孢子含水量较低（一般为40%左右且大部分含的是结合水，小部分是游离水。游离水：干重法可测得； 结合水：不易蒸发、不冻结、也不能渗透,占水总量的17%28%。,2、有机物质 （1）在细胞的全部干物质中，90%以上是有机物质。 （2）构成的有机元素有：C、
3、H、O、N。通常C与N在细胞成分中的比例约为C：N4:1。（3）有机物质包括：蛋白质 大部分与其它物质形成结合蛋白。核蛋白（核酸+pr） 合成Pr的场所； 脂蛋白（脂类+pr）构成各种膜系统核酸 两种：DNA、RNA；含量：细菌真菌 酵母霉菌糖类 有单糖、双糖和多糖。 A大部分以多糖的形式存在（肽聚糖、葡聚糖、甘露聚糖）。 B作为细胞的结构物质，参与细胞的组成。 C作为细胞的贮藏物质,（三）微生物细胞化学组成含量的变化,微生物细胞的化学组成,此组成可因菌种的种类、菌龄、培养基组成、培养条件、分析方法等而有所不同。,二、营养物质及其生理功能,碳源 氮源 无机盐 生长因子 水,（一）、碳源（Car
4、bon source）,定义：凡能为微生物提供碳素营养的物质。,功能：构成细胞物质和代谢产物中的碳素; 提供微生物生长发育所需要的能源。种类: 无机含碳化合物：如CO2和碳酸盐等。 有机含碳化合物：糖与糖的衍生物（多糖：如淀粉、麸皮、米糠等；饴糖；单糖）、 脂类、烃类、醇类、有机酸。,假单胞：能利用90多种碳源。 甲烷氧化菌：只能利用甲烷、甲醇 某些纤维素分解菌，只能利用纤维素。,不同微生物，对碳源的利用能力不同。,微生物工业发酵中用做碳源的原料,代粮节粮？纤维素、石油、CO2、H2生产SCP,传统种类： 糖类（单糖、饴糖、糖蜜、水解糖） 淀粉（薯类、谷类、玉米粉、山芋粉、野生植物淀粉等） 农
5、副产品(麸皮、米糠） 工业废料（酒糟、废糖蜜、亚硫酸废液）,凡能构成微生物细胞中氮素来源的营养物质。 种类：分子态：（N2）主要是一些固氮微生物无机氮：无机氮化物 NO3- NO2- NH4+等； 有机氮：脲、胺、氨基酸、蛋白质、嘌呤或嘧啶实验用氮源：牛肉膏、蛋白胨、酵母膏工业用氮源：尿素、氨水、花生饼粉、豆饼粉、麸皮、鱼粉、玉米浆等 功能： 1）提供合成细胞原生质（蛋白质、核酸）及其他结构的原料； 2）为少数细菌提供能源（铵盐、硝酸盐）。,（二）氮源（Nitrogen source ）：,硝酸盐NO3 NH4+,蛋白氮必须通过水解之后降解成胨、肽、氨基酸等才能被机体利用，这种氮源叫迟效氮源。
6、无机氮源或以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。,铵 盐 氨基酸 入胞 细胞物质 蛋白胨,豆 饼 蚕蛹粉,分解 入胞 细胞物质,诱导酶,诱导酶,生理酸性盐和生理碱性盐,（三）无机盐（inorganic salt）,定义：为微生物细胞生长提供碳、氮源以外的多种重要元素（包括大量元素和微量元素）的物质，多以无机盐的形式共给。 大量元素：P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe （微生物生长所需浓度在10-310-4mol/L） 微量元素：Cu、Zn、Mn、Mo、Co （微生物生长所需浓度在10-610-8mol/L）,一般微生物生长所需要的无机盐少，特别是微量无
7、素，常混杂在其它营养养质里，除特别需要外，一般不必另外添加。,1、构成细胞的组成成分 磷构成细胞膜 2、作为酶活性基组成成分，参与酶的组成P COA COI COS VB1 生物素硫辛酸，谷胱甘肽Fe 过氧化氢酶，细胞色素氧化酶 3、作为酶的激活剂 Ca K 4、调节细胞的渗透性、酸碱度 5、作化能自养菌的能源,无机盐的生理功能：,（四）生长因子（growth factor）：,定义:是微生物维持生命活动所不可缺少而需要量又不多特殊营养物质。通常微生物自身不能用简单的碳源或氮源合成，或合成量不足以满足机体生长需要的有机营养物质。不同微生物需求的生长因子的种类和数量不同。,缺乏合成生长因子能力的
8、微生物称为“营养缺陷型”微生物。,categories: Growth factors are organized into three categories:,1. purines and pyrimidines: required for synthesis of nucleic acids (DNA and RNA) 2. amino acids: required for the synthesis of proteins 3. vitamins: needed as coenzymes and functional groups of certain enzymes,生长素通常由酵母
9、膏、动物肝浸出液或某些果实浸出液（马铃薯、麦芽汁、玉米浆）提供。,有些微生物缺乏或丧失合成某种或某些氨基酸的酶，所以不能合成生长所必需的氨基酸，这类微生物被称为“氨基酸缺陷型”。,最早发现的生长因子是维生素，目前已经发现许多维生素都能起生长因子的作用。维生素大部分是构成酶的辅基或辅酶，需要量很少，但是缺少维生素微生物不能正常生长。,根据微生物对生长因子的需要存在差异，可分为：,1. 野生型(wild type) 原养型不需要生长因子而能在基础培养基上生长的菌株。 2. 营养缺陷型(auxotroph)由于自发或诱发突变等原因从野生型菌株产生的需要提供特定生长素物质才能生长的菌株。,水的生理功能
10、： 1、水是微生物细胞的重要组成成分，占营养细胞70%90%。 2、水是良好的溶剂。营物吸收，代谢产物的排泄，代谢反应物的代谢反应。 3、水直接参与某些代谢反应如水解反应，光合作用。 4、可有效调节细胞内的温度。,（五）水（water）,缺水比饥饿更易死,三、微生物的营养类型,根据生长所需要的营养物质的性质（碳源），可将生物分成：异养型生物：在生长时需要以复杂的有机物质作为营养物质 自养型生物：在生长时能以简单的无机物质作为营养物质动物属于异养型生物，植物属于自养型，而微生物既有异养型的也有自养型的，大多数微生物属于异养型生物，少数微生物属于自养型生物。根据生长时能量的来源不同分成： 化能营养
11、型生物：依靠化合物氧化释放的能量进行生长 光能营养型生物：依靠光能进行生长动物和大部分微生物属于化能营养型生物，它们从物质的氧化过程中获得能量。植物和少部分微生物属于光能营养型生物按供氢体分：,无机营养型生物：以还原性无机物为电子供体。 有机营养型生物：以有机物为电子工体。,营养类型,化能异养型微生物多数微生物属于化能异养型，其生长所需要能量和碳源通常来自同一种有机物。根据化能异养型微生物利用有机物的特性，又可以将其分为下列两种类型： 腐生型微生物：利用无生命活性的有机物作为生长的碳源。 寄生型微生物：寄生在生活的细胞内，从寄生体内获得生长所需要的营养物质。存在于寄生与腐生之间的中间过渡类型微
12、生物，称为兼性腐生型或兼性寄生型。,自养微生物：不依赖任何有机营养物即可正常生活的微生物。 异养微生物：至少需要提供一种大量有机物才能满足其正常营养要求的微生物（即其碳源必须是有机物，供氢体是有机物，能源可以是氧化有机物活利用日光能）,关于营养类型的定义：,第二节 培养基(medium),定义：由人工配制的、用来培养微生物的营养基质。 特点：任何培养基都应具备微生物所需要的五大营养要素，且应比例适当。所以一旦配成必须立即灭菌。,用途：促使微生物生长；积累代谢产物；分离微生物菌种；鉴定微生物种类；微生物细胞计数；菌种保藏；制备微生物制品,一、培养基的配制原则,（一）培养基组分应适合微生物的营养特
13、点（目的明确） （二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调） （三）物理化学条件适宜（条件适宜） （四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）,（一）培养基组分应适合微生物的营养特点,即根据不同微生物的营养需要配制不同的培养基。就微生物的营养类型而言：自养型和异养型微生物。就微生物主要类群而言：它们所需要的培养基成分也不同：细菌：牛肉膏蛋白胨培养基放线菌：高氏一号培养基真菌：查氏合成培养基PDA (Potato-Dextrose-Agar)酵母菌：麦芽汁,（二）营养物的浓度与比例应恰当,浓度过高微生物的生长起抑制作用，浓度过小不能满足微生物生长的需要。 碳氮比（C/N）直接影响微生物生长与繁殖
14、及代谢物的形成与积累，故常作为考察培养基组成时的一个重要指标；,速效性氮（或碳）源与迟效性氮（或碳）源的比例各种金属离子间的比例,碳源中的碳原子的mol数 氮源中所含的氮原子的mol数,C/N比值=,例：谷氨酸生产中C/N 4/1时，菌体大量繁殖，谷氨酸积累少； C/N3/1 时，菌体生长受抑制，而谷氨酸大量增加。,（三）物理化学条件适宜,（1）pH: 各类微生物的最适生长pH值各不相同： 细 菌：7.08.0 放线菌：7.58.5酵母菌：3.86.0 霉 菌：4.05.8 调节方式：A配制培养基时，用1摩尔浓度的NaoH或HCl调B生长过程中酸碱度的改变用缓冲剂（K2HPO4KH2PO4）C
15、微生物大量产酸时，用CaCO3(不溶性)中和D、生产中按实际需要不断向发酵液流加酸或碱液,（三）物理化学条件适宜（续）,（2）渗透压,渗透压 等渗溶液 适宜微生物生长高渗溶液 细胞发生质壁分离低渗溶液 细胞吸水膨胀，直至破裂,大多数微生物适合在等渗的环境下生长，而有的菌如Staphylococcus aureus则能在3mol/L NaCl的高渗溶液中生长。能在高盐环境（2.86.2/L NaCl）生长的微生物常被称为嗜盐微生物（Halophiles）。,（3）氧化还原电势(redox poyential),各种微生物对培养基的氧化还原电势的要求： 好氧微生物：+0.3+0.4V,(在0.1V
16、以上的环境中均能生长).厌氧微生物：只能在+0.1V以下生长 兼性厌氧微生物：+0.1V以上呼吸、+0.1V以下发酵培养基是多氧化还原偶的复杂电化学系统，测出的Eh值仅代表其综合结果。 对微生物影响最大的是：分子氧和分子氢的浓度 培养基中常用的还原剂：巯基乙酸、抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。,（四）根据培养基的应用目的选择原料及其来源,该培养基的应用目的，即：是培养菌体还是积累代谢产物？是实验室种子培养还是大规模发酵？代谢产物是初级代谢产物还是次级代谢产物？,用于培养菌体种子的培养基营养应丰富，氮源含量宜高（碳氮比低）； 用于大量生产代谢产物的培养基其氮源一般应比种子培养
17、基稍低，（但若发酵产物是含氮化合物时，有时还应提高培养基的氮源含量）；若代谢产物是次级代谢产物时要考虑是否加入特殊元素或特定的代谢产物； 当所设计的是大规模发酵用的培养基时，应重视培养基中各成份的来源和价格，应选择来源广泛、价格低廉 的原料，提倡以粗代精，以废代好。,二、培养基的类型及其应用,-1 根据所培养微生物的微生物类群来分细菌培养基；放线菌培养基；霉菌培养基 酵母菌培养基。 -2 根据培养目的来分种子培养基(seed culture medium)是为保证发酵生产获得大量优质种子而设计的培养基，特点是营养较丰富，氮源比例较高。有时为使菌种能迅速适应后面的发酵条件，还有意识地加入发酵培养
18、基的基质。发酵培养基(fermentation medium)用于生产预定发酵产物，一般以碳为主要元素，碳源含量往往高于种子培养基。大规模生产时，原料应价廉易得，还应有利于下游的分离提取。,-1,细菌培养基营养肉汤（nutrient broth)： 牛肉膏 3g； 水 1000ml；蛋白胨 5g ； pH 7.27.4 放线菌培养基高氏1号：可溶性淀粉 20g； KNO3 1g; K2HPO4 1gMgSO4 0.5g NaCl 1g; FeSO47H2O 0.5g水 1000ml; pH 7.27.4 霉菌培养基查氏（zapek)培养基：蔗糖 30g; KCl 0.5g; MgSO4.H2O
19、 0.5g;FeSO4 0.5g 水 1000ml; K2HPO4 1g;NaNO3 3g; pH 6.7 酵母菌培养基麦芽汁培养基,味精生产菌北京棒状杆菌AS1299的一级种子（用摇床培养） 培养基配方：,葡萄糖 3% 玉米浆 2.53.5% 尿素 0.30.5% K2HPO4 0.10.2% MgSO4 0.05%,二级种子（1200升发酵罐）培养基配方：以水解糖3%代替葡萄糖3%，其他成分相同。,-3 按对培养基成分的了解程度来分天然培养基(complex medium)：也称作chemically undefined medium。利用生物的组织、器官以及它们的抽提物或制品制成的培养基
20、即利用化学成分还不完全清楚或不恒定的天然物质（麦芽汁、米曲汁、豆芽汁、玉米粉、麸皮、马铃薯、豆饼粉、花生饼粉、鱼粉、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏）制成的培养基。合成（组合）培养基(synthetic medium)：也称作chemically defined medium. 由已知成分和数量的化学药品配制而成的培养基。该类培养基的组成成分精确、清楚，重复性强，但微生物生长较慢。 半合成培养基(semi-defined medium)：在一部分采用天然材料，部分用已知的化学药品组成的培养基 .如马铃薯蔗糖培养基,-4 按培养基的物理状态来分 液体培养基(liquid medium)：将各营养成分按一定
21、的量加入定量水溶解后即成。 固体培养基(solid medium)：在液体培养基中加入一定量能固化的胶体物质而制成。天然固体营养基质制成的培养基. 半固体培养基(semi-solid medium)：在液体培养基中加入0.2-0.7的琼脂构成的培养基。,1.不被微生物分解、利用、液化； 2.不因消毒灭菌而被破坏； 3.在微生物的生长温度内保持固态； 4.凝固点的温度对微生物无害； 5.透明度好，粘着力强,理想凝固剂应具备的条件,-5 按特殊用途划分 1、生理特性试验用培养基 糖发酵培养基 ：判断产酸、产气情况，指示剂为酸性复红。明胶培养基：判断蛋白酶的产生情况穿刺30培养冰箱观察液化情况淀粉培
22、养基：判断淀粉酶的产生与产量碘液培养 透明圈,2、增殖培养基,定义：为从混杂的微生物群体中分离出某一种微生物而设计的适于该种微生物在其中迅速生长（占优势），其它微生物逐渐被淘汰。常用于菌种筛选。如： 滤纸条培养基：筛选纤维素分解菌滤纸无机盐（无纤微素粉、琼脂碳源）石蜡油培养基：在基础培养基上加入石蜡油作碳源，筛选石油脱腊酵母。,3、选择性培养基 (selective medium),定义：在培养基中加入某种药剂（抑菌剂、杀菌剂）以抑制不需要的微生物生长。 分离石油脱蜡酵母：加氯霉素抑细菌 分离放线菌：加10%酚数滴抑细菌、霉菌 分离酵母、霉菌：加PC、四环素、链霉素抑细菌、放线菌 分离G（）：
23、加结晶紫、抑G（+）,4、鉴别培养基 differential medium,定义：在培养基中加入某种试剂，使培养后发生某种变化，从而区别不同类型的微生物。 伊红一美兰培养基（EMB）：区别大肠与产气杆菌。大肠杆菌发酵乳糖时能使伊红与美兰结合成黑色化合物，菌落呈紫黑色、有金属光泽，较小；而产气菌菌落较大，温润，呈棕色。,EMB(Eosin Methylene Blue),Figure 14. Left: Escherichia coli cells. Right: E. coli colonies on EMB Agar.,5、基础培养基 minimum medium,定义：是含有一般微生物生
24、长繁殖所需的基本营养物质的培养基。另外基础培养基也可作为一些特殊培养基的基础成分（如制备糖发酵培养基时）.,6、加富培养基 enriched medium,定义：在普通培养基中加入某些特殊的营养物，如血、血清、动、植物组织液或其他营养物质（或生长因子）的一类营养丰富的培养基。 用来培养营养要求苛刻的微生物，或用以富集（数量上占优势）和分离某种微生物.,（四）其它,对于专性寄生的微生物如病毒、立克次氏体等，不能人工培养在普通培养基上。通常是接种在动植物体内，动植物组织或细胞里培养。常用的动物有小白鼠、家兔、豚鼠等。可用鸡胚培养新城域鸡瘟病毒、牛痘病毒、天花病毒、狂犬病毒等。将病毒注射到鸡胚的绒毛
25、尿囊膜、尿囊、羊膜囊或卵黄囊中培养即可得。,三、培养基的配制方法,1、按照配方的组成及用量分别称量及配成液体 2、调酸碱度 3、配固体培养基加入2%琼脂并加热熔化 4、分装试管、瓶并塞上棉塞 5、包扎、灭菌、备用,例一：斜面培养基的配制程序 按比例计算各营养成分的量称量量水加热熔化琼脂加其它成分调酸碱度补足水分分装加塞包扎灭菌摆斜面 例二：平板培养基的配制程序称料熔解定溶调酸碱度装瓶加2%琼脂加塞包扎灭菌倒平板冷凝备用,高压蒸气灭菌一般培养基: 1.05 Kg/cm2, 121.3, 15-30 min含糖培养基: 0.56 Kg/cm2, 112.6 , 15-30 min,培养基的灭菌,第
26、三节营养物质进入细胞,某种物质能否作为营养物支持微生物生长，首先取决于它能否进入细胞，其次决定于微生物是否具有利用它的能力。,那确实！,一、细胞质膜的结构与透性,物质进出细胞，有三道屏障：荚膜、粘液层 蔬松对物质的运输影响较小细胞壁 粗筛，允许一定分子大小物质通过，无选择性细胞质膜 半渗透膜，高度的选择性,细胞质膜的透性,水分子最易透过。 大分子物质必须由胞外酶水解成小分子可溶于水的物质才可透过。 脂溶性物质比水溶性物质更易透过。 弱电解质比强电解质易透过。 低价离子比高价离子易透过。,谷氨酸生产菌：生物素缺陷型脂肪酸磷脂细胞膜缺损膜透性,实际生产中,二、营养物质吸收方式,被输送的物质，靠细胞
27、内外浓度为动力，以透析或扩散的形式从高浓度区向低浓度区的扩散。,1、单纯扩散 simple diffusion or passive diffusion),单纯扩散simple diffusion or passive diffusion),特点： 扩散是非特异性的营养物质吸收方式：如营养物质通过细胞膜中的含水小孔，由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内扩散；在扩散过程中营养物质的结构不发生变化：即既不与膜上的分子发生反应，本身的分子结构也不发生变化；物质运输的速率较慢：速率与胞内外营养物质的浓度差有关，即随细胞膜内外该物质浓度差的降低而减小，直到胞内外物质浓度相同； 不需要载体参与；扩散是一个不需
28、要代谢能的运输方式：因此，物质不能进行逆浓度运输。 可运送的养料有限：限于水、溶于水的气体，及分子量小，脂溶性、极性小的营养物质。,smosis,flows towards high salt concentrations,单纯扩散模式图,细胞膜外,细胞膜内,细胞膜,2、促进扩散(facilitated diffusion),特点：在促进扩散过程中营养物质本身在分子结构上也不会发生变化不消耗代谢能量，故不能进行逆浓度运输运输的速率由胞内外该物质的浓度差决定 需要细胞膜上的载体蛋白（透过酶）参与物质 运输 被运输的物质与载体蛋白有高度的特异性 养料浓度过高时, 与载体蛋白出现饱和效应 促进扩散的
29、运输方式多见于真核微生物中，例如通常在厌氧生活的酵母菌中，某些物质的吸收和代谢产物的分泌是通过这种方式完成的。,3、主动运输(Active transport),特点：物质在主动运输的过程中需要消耗代谢能可以进行逆浓度运输的运输方式需要载体蛋白参与对被运输的物质有高度的专一性被运输的物质在转移的过程中不发生任何化学变化不同的微生物在主动运输过程中所需的能量的来源不同，好氧微生物中直接来自呼吸能，厌氧微生物主要来自化学能，光合微生物中则主要来自光能 。主动运输是微生物吸收营养物质的主要方式。,主动运输模式图,细胞膜,细胞膜外,细胞膜内,恢复原构象,移位,再循环,结合,构象改变,Na+-K+-AT
30、P酶系统,Na+-K+-ATPase是存在于原生质膜上的一种重要离子通道蛋白 功能:利用ATP能量将Na+由细胞内“泵”出胞外,并将K+“泵”入胞内。该酶由大小两个亚基组成（MW: 12万, 5.5万）,作用步骤: 1. ATP酶(E)在细胞内侧与3个Na+结合,同时消耗能量; 2. 磷酸化ATP酶(E+)构象变化将Na+排除胞外,并与2个K+结合; 3. K+激发E+脱磷酸化恢复为E, 同时将K+运入细胞.,基因转位是一种特殊的主动运输，与普通的主动运输相比，营养物质在运输的过程中发生了化学变化（糖在运输的过程中发生了磷酸化）。其余特点与主动运输相同。基因转位主要存在于厌氧和兼性厌氧型细菌中
31、，也主要是用于单（或双）糖与糖的衍生物，以及核苷与脂肪散的运输,4、基团转位(Group translocation),在酶的作用下HPr被激活,在酶的作用下P-HPr将磷酸转移给糖,运送机制:是依靠磷酸转移酶系统,即磷酸烯醇式丙酮酸-己糖磷酸转移酶系统. 运送步骤: (1)热稳载体蛋白(HPr)的激活细胞内高能化合物磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的磷酸基团把HPr激活。酶1PEP+HPr 丙酮酸+P-HPr HPr是一种低分子量的可溶性蛋白，结合在细胞膜上，具有高能磷酸载体的作用。,(2)糖被磷酸化后运入膜内膜外环境中的糖先与外膜表面的酶2结合，再被转运到内膜表面。这时，糖被P-HPr上的磷酸激活，并通过酶2的作用将糖-磷酸释放到细胞内。酶2P-HPr+糖 糖-P +HPr 酶2是一种结合于细胞膜上的蛋白，它对底物具有特异性选择作用，因此细胞膜上可诱导出一系列与底物分子相应的酶2。,Special Cases 1. Endocytosis 2. Exocytosis,膜泡运输,四种运输营养物质方式的比较,思考题：,1、简述微生物营养的五大要素及其功能。 2、列表说明微生物的四大营养类型。 3、细胞质膜的结构与透性各有何特点。 4、微生物吸收营养物质的方式有哪几种？各有何特点？ 5、什么叫培养基？按营养物质的来源可分哪几种？ 6、试述培养基的制备原则及制备方法。,
