1、 猪冠状动脉再狭窄模型的建立和血管内超声评价作者：丁澍，马根山，陈立娟，冯毅，沈成兴，刘孝军，王积慧【摘要】 目的 建立猪冠状动脉再狭窄模型，并用血管内超声（IVUS）进行评价。方法 选择健康小型猪 9 头，在左前降支中段植入金属裸支架支架/血管直径=（1.11.2）/1.0 ，术后第 28 天复查造影、IVUS，并行组织形态学检查观察再狭窄情况。 结果 4头猪在支架植入 2 h 内死亡，5 头猪完成 28 d 复查，定量冠脉造影（QCA）示支架植入后血管直径为 （2.900.26） mm，比植入前基础血管直径（2.520.31 ）mm 明显增大（ P =0.001）;随访期血管直径（1.20
2、0.77 ）mm 较植入后血管直径明显减小（ P =0.002），直径狭窄百分比为（60.223.5 ） %，支架内再狭窄率为60%。组织形态学检查 示管腔面积与支架内面积相比明显减小（1.291.02）mm 2vs（6.041.21 ）mm2，P 0.01，平均面积狭窄百分比为（77.919.7 ）% 。IVUS 检查结果类似管腔面积（1.671.17）mm2vs（5.85 0.94）mm2 ， P 0.01; 平均面积狭窄百分比为 （71.023.3）%。两种检查手段测得的支架内面积、管腔面积、新生内膜面积和平均面积狭窄百分比相比差异无统计学意义 （ P 0.05） 。结论 成功建立猪冠状
3、动脉再狭窄模型，IVUS 检查可作为猪冠脉再狭窄模型支架内再狭窄的评价手段。 【关键词】 冠状动脉模型;血管再狭窄;血管内超声;新生内膜; 猪经皮腔内冠状动脉成形术（PTCA）和支架植入术的临床应用极大地改善了冠心病患者的预后，但 10% 50%的再狭窄率限制了PTCA 和支架植入术的发展。本研究以小型猪冠状动脉植入较大直径支架建立再狭窄模型，并通过血管内超声（IVUS）进行评价。1 材料和方法 1.1 动物选择和材料准备健康小型猪 9 头，体重 3040 kg，月龄 69 个月，雌雄不限，整个实验期间予普通谷物饲养。维科医疗器械有限公司提供的金属裸支架 9 枚，均为管状，直径 2.53.0
4、mm，长 1520 mm。小鼠抗增殖细胞核抗原（PCNA）抗体（clone PC10，DAKO ）浓缩液和抗体稀释液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。1.2 支架植入方法术前日喂饲拜阿司匹林 300 mg、波立维 225 mg。禁食禁水12 h，予氯胺酮（12mgkg-1）肌注基础麻醉， 3%戊巴比妥钠 20 mg kg-1 术前和术中间断静注强化麻醉。用外科手术方法暴露颈动脉或股动脉，置 6F 鞘管，注入肝素 150200 U kg-1，行定量冠状动脉造影 （QCA）并在左前降支中段植入金属裸支架 1 枚支架/ 血管=（1.1 1.2）/1.0，扩张压为 1015 atm （1 atm=
5、101.325 kPa），每次 30 s，两次扩张间隔 1 min。 15 min 后复查 QCA 证实管腔通畅，无充盈缺 损、管壁夹层和支架移位。行 IVUS 检查（JOMED Viewsonic PF 775）证实支架贴壁良好。术毕结扎动脉，青霉素 480 万 U d-1 肌注 3 d 预防感染;波立维 75mgd-1 喂饲 28 d;拜阿司匹林 300 mgd-1 喂饲 7 d 后改为 100 mgd-1 喂饲 21d，共 28 d。1.3 QCA 和 IVUS 复查术后 28 d 行 QCA 和 IVUS 检查观察再狭窄情况。随访期QCA 测定血管参考直径，在支架段血管近 端、中间、远
6、端测定后取平均值。 平均直径狭窄百分比（%）= （1- 随访期血管参考直径/植入后直径）100 。IVUS 检查测定支架内面积、管腔面积; 新生内膜面积= 支架内面积- 管腔面积; 面积狭窄百分比（%）=（1- 管 腔面积/支架内面积）100。1.4 组织形态学检查和免疫组化QCA 和 IVUS 复查后予 10%氯化钾静注处死动物，分离心脏，10%中性缓冲福尔马林液从主动脉残端以 100 mmHg（1 mmHg = 0.133 kPa ）压力灌注固定 30 min。分离含支架血管段，从支架正中横切，近段标本以 10%中性福尔马林固定 24 h，送至上海中山医院 心脏病研究所制成 100 m厚切
7、片并行 HE 染色。计算支架内面积、管腔面积、新生内膜面积和狭窄面积百分比。冠脉损伤程度根据Schwartz 等的方法计算损伤评分。远段标本移去支架丝，切片行PCNA 染色，通过计算机辅助系统放大 400 倍在新生内膜中随机取 5 块 0.1 mm2 大小区域计算平滑肌细胞密度（SMCs），通过计算PCNA 阳性 SMCs 占总 SMCs 的比例得出 增殖 SMCs 比值。2 统计学分析 计量资料以 x-s 表示，用 SPSS 11.5 统计软件行 t 检验， P 0.05 差异有统计学意义， P 0.01 差异有 非常显著性意义。3 结 果 9 头小型猪均成功在前降支中段植入金属裸支架，其中
8、 4 头在支架植入后 2 h 内死亡，死因分别为急性心包压塞、大出血和麻醉意外。死亡后即刻分离支架血管段，小心抽去支架丝，HE 染色光镜下见支架段 血管内弹力膜剥脱，中膜压缩，局部较多炎症细胞聚集（图 1）。支架近端血管和远端血管管壁正常，偶见少数 炎症细胞局部聚集。其余 5 头猪安全存活至试验期结束，复查 QCA 示支架植入后血管直径为（2.900.26 ）mm ，比植入前基础血管直径（2.520.31）mm明显 增大（P =0.001），支架/血管比为1.130.02;随访期血管直径（1.200.77 ）mm，较植入后血管直径明显减小（ P =0.002），直径狭窄百分比为（60.2 23
9、.5）%，支架内再狭窄率为 60%，成功建立猪冠状动脉再狭窄 模型。IVUS 和组织形态学检查结果见表 1 和图 2，两种检查手段测得的支架内面积、管腔面积、新生内膜面积、平均面积狭窄百分比比较差异无统计学意义，提示 IVUS 可替代组织形态学检查来定量评价支架内再狭窄情况;管腔面积与支架内面积相比均明显减小，提示新生内膜增生明显。 表 1 术后 28 d IVUS 和组织形态学检查结果比较（略）4 讨 论 近年来的研究表明，PTCA 术后再狭窄的机制主要是新生内膜增生、血栓形成、血管重构和血管的弹性回缩1-2。支架的应用消除了血管重构和血管弹性回缩，但并未阻止甚至促进了以平滑肌增殖和迁移为特
10、征的新生内膜增生。以往曾经选用犬、家兔、大鼠等多种动物作为再狭窄模型，但均不合适3-5。犬有双重冠脉系统，新生内膜不易诱导成功。兔髂动脉和颈总动脉球囊扩张后狭窄系非平滑肌细胞增殖迁移所致。大鼠对动脉粥样硬化具有抗性，诱导的再狭窄病变与人类相比在形态学和病理生理学上都有很大差异。非人灵长类种间差异复杂、获取困难、饲养费用高等限制了其应用6。成年猪的冠状动脉分布、口径、结构与人相似，冠脉血流动力学特征和血小板特点也与人类似，从脂质沉淀、泡沫细胞形成到纤维细胞增生钙化的时序也与人相同。对猪冠状动脉采用大球囊扩张术后易形成损伤性狭窄，病理过程与人 PTCA 术后再狭窄相仿7。本研究采用小型猪冠脉内植入
11、较大支架支架/ 血管=（1.11.2 ）/1.0成功诱发了支架内新生内膜增生，病理和免疫组化结果提示支架内狭窄明显，新生内膜平滑肌细胞增殖和细胞外基质增生，与人支架植入术后再狭窄病理过程相似，与国内外文献8-9 报道一致。国外相关研究表明，猪冠脉内弹力膜断裂和中膜压缩撕裂可诱导明显的平滑肌细胞迁移和增殖，导致新生内膜增生和再狭窄，并且不依赖于高胆固醇饮食7。与血管直径相仿的球囊或支架仅诱导轻微的内膜增生10，过大球囊扩张或过大直径支架植入使内膜增生明显。本实验血管损伤评分均在 1 分以上，均在支架植入部位诱导了明显的内膜增生。本实验观察到内膜和中膜损伤后 2 h 即出现炎性细胞局部浸润，炎性细
12、胞的浸润和炎症介质的释放可激活血小板和凝血系统，在支架撑竿处及内弹力膜断裂处形成微小血栓。局部炎症在术后第 7 天达到顶峰，此后处于平台期，28 d 时仍然明显11。炎症反应和血栓的形成在再狭窄早期占有重要地位，而伴随着炎性细胞浸润的平滑肌细胞迁移增殖则逐渐成为再狭窄形成的主要动力。初期少量的增殖平滑肌细胞与机化的纤维蛋白血栓、中性粒细胞、巨噬细胞形成混合体，之后增殖加速，在术后第 7 天时达最快速度，28 d 时内膜增生达到顶峰，并一直持续至术后 36 个月3。本研究的一个特点是通过 IVUS 评价猪冠脉再狭 窄模型。IVUS 不仅可以观察血管腔大小、管壁的组成和病变等形态结构，而且可以观察
13、其收缩和舒张等功能变化;不仅可以对病变进行定性分析，而且还可以进行精确的定量分析，这是离体的组织学检查等其他 检查手段12-13所不能相比的。本研究支架植入后经 IVUS 检查证实支架贴壁良好，无局部血管夹层、动脉瘤、血管壁内血肿或血管破裂及较大的新鲜血栓形成，消除了影响术后支架内再狭窄率的因素，控制了操作过程中引起的偏倚。术后28 d IVUS 和组织形态学检查对支架段血管结构、支架内斑块负荷、支架内再狭窄率等所得结果相似，也证实了 IVUS 可作为支架内再 狭窄研究的很好手段。近年来 Kursaklioglu 等14报道了在猪冠脉再狭窄模型中采用 QCA 和 IVUS 相结合的方法观察紫杉醇洗脱支架预防再狭窄的作用，Yokoyama 等15也报道了采用定量 IVUS观察猪模型 中抗氧化剂普罗布考抑制新生内膜增生的实验，国外还有其他类似报道16-17，国内尚未有报道。【
