1、 滋阴明目丸微生物限度检查方法的建立【关键词】 滋阴明目丸；微生物限度检查；验证试验滋阴明目丸是由熟地黄、黄精、枸杞子、山药、当归、川芎等 17味中药组方而成的复方制剂。对其进行微生物限度检查时,按照规定1,必须进行方法验证试验,为此本试验对滋阴明目丸微生物限度的具体检查方法进行了验证,现总结现报道如下。1 仪器与试药Q/YYX1030-82 型电热手提式压力灭菌器； 101-2s 电热恒温鼓风干燥箱(上海跃进医疗器械厂)；DHP781 型恒温培养箱( 湖北省黄石市医疗器械厂)；SPX-250C 型恒温恒湿培养箱(上海博迅实业有限公司医疗设备厂)；SPX-103 型净化工作台(安徽蚌净化设备厂
2、)；漩涡混合器(江苏海门麒麟医用仪器厂)；CSY-型不锈钢电热恒温水浴锅(北京医疗设备厂) 。 菌种：大肠埃希菌CMCC(B)44102；金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003；枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501；白色念珠菌CMCC(F)98001；黑曲霉菌CMCC(F)98003。营养琼脂培养基(中国药品生物制品检定所,批号 20050103)；玫瑰红钠琼脂培养基(中国药品生物制品检定所,批号 20061109)；胆盐乳糖增菌培养基(中国药品生物制品检定所,批号 20070106)；改良马丁琼脂培养基(中国药品生物制品检定所,批号 20060915)；MUG 快检试剂(中国药品生物制品检
3、定所,批号 20061211)；蛋白胨(上海中洋生物公司东海药厂,批号 060512)。其他试剂均为分析纯。pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲溶液,照 2005 年版中华人民共和国药典( 一部)配制。试验样品：滋阴明目丸(本院自制,批号 070305、070419、070821) 。2 实验方法与结果2.1 菌液制备取经 37 培养 1824 h 的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌与枯草芽孢杆菌 3 种菌种,分别接种于 10 mL 营养肉汤中,置 37 培养箱中接着 1824 h,用 0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至 1O-51O-7 约为5O100 cfu,备用。 取白色念珠菌接种于 10 mL 改
4、良马丁培养基中,置 2328 培养 1824 h,用 0.9%灭菌氯化钠溶液稀释至 1O-51O-7 约为 5O100 cfu,备用。 取经 2328 培养 1 周的黑曲霉改良马丁琼脂斜面培养物,加 0.9%无菌氯化钠溶液 35 mL,将孢子洗脱,用管口带有薄无菌棉花的无菌毛细吸管吸出孢子悬液,置无菌试管内,用 0.9%无菌氯化钠溶液稀释为 1 mL 含孢子数 5O100 cfu 的孢子悬液,备用。2.2 供试液的制备各取 2 个最小包装共 10 g 供试品(批号 060402),加入 pH 7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至 100 mL,振摇,使分散均匀,作为 110 的供试液。2.3 细
5、菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证试验组：取供试液 1 mL 和 5O100 cfu 试验菌,分别注入平皿中,每株菌平行制备 2 个平皿。菌液组：测定所加的试验菌数。供试品对照组：取供试液注入平皿中,测定供试品本底菌数。稀释剂对照组：取稀释剂和 5O100 cfu 试验菌,分别注入平皿中,测定每株平行制备2 个平皿。结果见表 1。表 1 回收率测定结果（略）表 1 结果表明,3 次平行试验,滋阴明目丸 5 株菌的回收率均大于 7O%,表明滋阴明目丸按常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数,经方法学验证试验成立。2.4 大肠菌群的验证试验试验组：取 110、1100 的供试液 1 mL,分别接入 10 m
6、L 胆盐乳糖发酵培养基中,分别加入大肠埃希菌混悬液 1 mL, 3035 培养24 h,观察结果。阴性对照组：除菌液为金黄色葡萄球菌 1 mL,方法同试验组。阳性对照组：除不加供试液,其他操作同试验组。结果见表2。表 2 大肠菌群验证试验结果（略）2.5 控制菌验证试验试验组：取批号为 060402 的 110 供试液 10 mL,加入大肠埃希菌液 1 mL,接入 100 mL 胆盐乳糖培养基中,35 培养 24 h；取上述培养物 0.2 mL,接种至 5 mL MUG 培养基的试管中,35 培养 24 h；观察后,沿管壁加入数滴靛基质试液,观察结果。阴性菌对照组：除菌液为金黄色葡萄球菌 1
7、mL,方法同试验组。阳性对照组：除不加供试液,其他操作同试验组。结果见表 3。表 3 大肠埃希菌验证试验结果（略）滋阴明目丸 3 次平行试验,试验组都检出大肠埃希菌,阴性菌对照组都未检出金黄色葡萄球菌,表明滋阴明目丸的控制菌检查方法按常规法,经方法学验证试验成立。2.6 样品检验结果取滋阴明目丸 3 批供试品(070305、070419、070821) 稀释液按常规法进行细菌、霉菌及酵母菌计数、控制菌检查,经检验符合规定。3 结论通过方法学验证试验得出：滋阴明目丸可按常规法进行微生物限度检查；进行霉菌及酵母菌计数和控制菌检查,按培养基稀释法(0.2 mL/皿)进行细菌计数。4 讨论由于中成药是含有多种成分的复合制剂,作用机理并不十分明确,其中任何成分具有抑菌作用均可影响微生物限度检查的准确性。因此,在研究滋阴明目丸微生物检查方法时,以 2005 年版中华人民共和国药典作为依据,并
