1、尹 丽 丽，郑 红，程 志，等.超 高 效 液 相 色 谱 法 检 测 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品中22种 游 离 氨 基酸J.食 品 工 业 科 技，2023，44（14）：264271.doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080065YIN Lili,ZHENG Hong,CHENG Zhi,et al.Determination of 22 Free Amino Acids in Food for Special Medical Purposes by Ultra-performance Liquid ChromatographyJ.Scienc
2、e and Technology of Food Industry,2023,44(14):264271.(in Chinese with Englishabstract).doi:10.13386/j.issn1002-0306.2022080065分析检测超高效液相色谱法检测特殊医学用途配方食品中22种游离氨基酸尹丽丽，郑红，程志，卢兰香，薛霞，王骏，胡梅，刘艳明*（山东省食品药品检验研究院，山东省特殊医学用途配方食品质量控制工程技术研究中心，山东省食品药品安全检测工程技术研究中心，山东济南 250101）摘 要：本 文 建 立 了 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品中22种 游 离
3、氨 基 酸 的 超 高 效 液 相 色 谱 检 测 方 法。样 品 中 氨 基 酸 用 磺 基水 杨 酸 提 取，以2,4二 硝 基 氟 苯（DNFB）为 柱 前 衍 生 试 剂，以 乙 腈 水-甲 酸 铵 为 流 动 相 梯 度 洗 脱，HSS T3色 谱 柱高 效 分 离，超 高 效 液 相-二 极 管 阵 列 检 测 器 检 测，外 标 法 定 量。结 果 显 示，22种 氨 基 酸在2100 g/mL 范 围 内 线 性关 系 良 好（R20.99）。方 法 检 出 限（S/N 3）为10 mg/100 g，定 量 限（S/N 10）为25 mg/100 g，低、中、高 三个 加 标
4、水 平 的 回 收 率在90.1%109.1%，相 对 标 准 偏 差为0.8%6.9%。方 法 简 单 高 效、准 确 度 高、重 复 性 好，适 用于 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品中22种 游 离 氨 基 酸 的 定 性、定 量 分 析，为 保 障 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 的 质 量 安 全 提 供 技术支持。关键词：特殊医学用途配方食品，游离氨基酸，柱前衍生，2,4二硝基氟苯，超高效液相色谱法本文网刊:中图分类号：S513 文献标识码：A 文章编号：10020306（2023）14026408DOI:10.13386/j.issn1002-0306.202208
5、0065Determinationof22FreeAminoAcidsinFoodforSpecialMedicalPurposesbyUltra-performanceLiquidChromatographyYINLili，ZHENGHong，CHENGZhi，LULanxiang，XUEXia，WANGJun，HUMei，LIUYanming*（Shandong Institute for Food and Drug Control,Shandong Research Center of Engineering and Technology for QualityControl of Fo
6、od for Special Medical Purposes,Shandong Research Center of Engineering and Technology for SafetyInspection of Food and Drug,Jinan 250101,China）Abstract：A method was established to determine 22 free amino acids in food for special medical purposes by ultra-performance liquid chromatography.After ext
7、raction with sulfosalicylic acid and derivation with 2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB),the samples were eluted with acetonitrile water-ammonium formate as mobile phase.Amino acids were separatedby HSS T3 column and detected with diode-array detector by external standard method.Results showed that,the 2
8、2 aminoacids were linear in the range of 2100 g/mL with correlation coefficients higher than 0.99.The limits of detection(S/N3)were 10 mg/100 g,and the limits of quantification(S/N10)were 25 mg/100 g.The recoveries were in the range of90.1%and 109.1%with relative standard deviation(RSD)from 0.8%to 6
9、.9%.This method was simple,efficient,accurateand reproducible.It was suitable for determination of 22 free amino acids in food for special medical purposes,which couldprovide technical support to ensure the quality and safety.Keywords：food for special medical purposes；free amino acid；pre-column deri
10、vatization；2,4-dinitrofluorobenzene；ultra-performance liquid chromatography 收稿日期：20220808 基金项目：2019年度山东省重点研发计划（医用食品）（2019YYSP020）。作者简介：尹丽丽（1987），女，本科，高级工程师，研究方向：食品安全分析与风险预警，E-mail：yinli_。*通信作者：刘艳明（1981），女，博士，研究员，研究方向：食品安全分析与风险预警，E-mail：。第 44 卷 第 14 期 食品工业科技 Vol.44 No.142023 年 7 月 Science and Technol
11、ogy of Food Industry Jul.2023 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 是 为 满 足 进 食 受 限、消化 吸 收 障 碍、代 谢 紊 乱 或 特 定 疾 病 状 态 人 群 对 营 养素或膳食的特殊需求，而专门加工配制而成的配方食品，如氨基酸代谢障碍配方食品。氨基酸作为合成蛋白质的重要原料，因其分子量小、易吸收常成为特殊医 学 用 途 配 方 食 品 首 选 的 营 养 添 加 剂，但 若 摄 入 不当，会 影 响 人 体 的 正 常 生 命 代 谢1。2019年 相 关 部门 积 极 整 顿 了 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 行 业 乱 象，被行 业
12、 称 为 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 发 展 元 年，截 至2020年，特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 已 注 册 超过45款，建 立 和 规 范 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 中 相 关 检 验 标 准及方法意义重大。GB 29922-20132规 定了22种 可 用 于 特 殊 医 学用 途 配 方 食 品 中 的 氨 基 酸 种 类 及 含 量，但GB 5009.124-20163中 分 析 的 目 标 物 仅限16种，未 能 覆 盖 胱氨 酸、瓜 氨 酸、鸟 氨 酸、色 氨 酸 和 谷 氨 酰 胺；卫 生 部公 布 的 食 品 中 可 能 违 法 添 加
13、的 非 食 用 物 质 和 易 滥用 的 食 品 添 加 剂 品 种 名 单（第 二 批）中 规 定的L-羟脯 氨 酸 属 于 非 法 添 加 氨 基 酸，但 目 前 的 检 验 标 准SN/T 3929-20144不 包 括 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 基质。国 外 报 道 的 氨 基 酸 检 测 对 象 大 多 为 生 物 样 品 或普通食品，与种类繁多、基质复杂的特殊医学用途配方食品差别大，使得常规检测手段难以直接应用。国内 针 对 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 的 已 报 导 文 献 目 前 仅有6-氨 基 喹 啉-N-羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 基 氨 基 甲
14、酸 酯（AQC）衍 生 法 5，该 方 法 限于GB 25596-20106中的19种 氨 基 酸，且 方 法 对 流 动相pH要 求 极 其 严 苛，适应性差。调 研 文 献 发 现，现 有 检 测 氨 基 酸 的 方 法 有 茚 三酮柱后衍生-氨基酸分析仪检测7、衍生化反应-液相色谱仪检测811、液相色谱-串联质谱法1215等，氨基酸 分 析 仪 检 测 目 标 物 局 限 性 强，仪 器 专 用，实 验 室 普及率低；液相色谱-质谱仪器本身价格昂贵，常采用的消 除 基 质 效 应 方 式-同 位 素 内 标 法12也 进 一 步 提 高了 检 测 成 本。本 文 拟 采 用 液 相 色
15、谱 法 检测22种 游离氨基酸。基于氨基酸本身没有紫外吸收，需经过衍生化反应引入生色基团后进行检测。据报道，用于柱前 衍 生 的 试 剂有6-氨 基 喹 啉-N-羟 基 琥 珀 酰 亚 胺 基氨基甲酸酯（AQC）16、邻苯二甲醛（OPA）17、异硫氰苯酯（PITC）1820、9-芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）2122、丹 磺 酰 氯（Dansyl-Cl）23、2,4二 硝 基 氟 苯（DNFB）2426等。其 中，AQC与 氨 基 酸 反 应 快，副 产 物 少，但 是 衍生试剂价格昂贵；OPA主要与一级氨基酸反应，不能与 二 级 氨 基 酸 直 接 反 应；PITC衍 生 过 程 需 去 除
16、 多 余的 衍 生 试 剂，且 痕 量的PITC会 缩 短 分 析 柱 的 寿 命；FMOC-Cl形 成 的 衍 生 产 物 需 萃 取，且 与 组 氨 酸 形 成衍生物不稳定，影响定量；Dansyl-Cl易生成多级衍生产 物；DNFB衍 生 技 术 虽 然 已 有 文 献 或 资 料 报 道，但与普通液相色谱联合检测也存在缺陷，如衍生反应时间长；使用5 m色谱柱2426柱效低，分析时间长；流动相采用N,N二甲基甲酰胺24、三乙胺25或者磷酸盐26，对环境、色谱柱、仪器均不友好等。本研究针对GB 29922-2013规定的所有氨基酸（色氨酸除外，因其具发色基团，可用紫外检测器直接测 定）和 非
17、 法 添 加的L-羟 脯 氨 酸，建 立了DNFB衍生 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品中22种 游 离 氨 基 酸 的 超高 效 液 相 色 谱 法，方 法 简 单 高 效、试 剂 绿 色 环 保，填补了GB 29922-2013中 检 测 方 法 缺 失 的 空 白，检 测范围扩增了L-羟脯氨酸。方法为特殊医学用途配方食品企业质量控制提供技术支持，为行业发展提供技术保障。1材料与方法 1.1材料与仪器天 冬 氨 酸（Asp）、谷 氨 酸（Glu）、丝 氨 酸（Ser）、谷 氨 酰 胺（Gln）、精 氨 酸（Arg）、苏 氨 酸（Thr）、脯 氨酸（Pro）、缬 氨 酸（Val）、蛋
18、氨 酸（Met）、异 亮 氨 酸（lle）、亮 氨 酸（Leu）、组 氨 酸（His）、苯 丙 氨 酸（Phe）、赖 氨 酸（Lys）、酪 氨 酸（Tyr）标 准 品 纯 度 均 99%，Dr.EhrenstorferGmbH公司；L-羟脯氨酸（L-Hyp）、瓜氨 酸（Cit）、丙 氨 酸（Ala）、胱 氨 酸（Cys）标 准 品 纯度 均 99%，Bepure公 司；甘 氨 酸（Gly）纯 度 99%，中国计量科学研究院；天冬酰胺（Asn）、鸟氨酸（Orn）标准品纯度99%，上海安谱实验科技股份有限公司；牛磺酸（Tau）标准品纯度 99.8%，Sigma-Aldr-ich公司；ACQUITY
19、 UPLC HSS T3色谱柱（2.1 mm100 mm，1.8 m）、ACQUITY UPLC BEH ShieldRP18色 谱 柱（2.1 mm100 mm，1.7 m）、ACCQ-TAG ULTRA C18色 谱 柱（2.1 mm100 mm，1.7 m）美国Waters公 司；甲 醇、乙 腈 均 为 色 谱 纯，美 国Fisher公司；盐酸、乙酸、氢氧化钠、甲酸铵、磺基水杨酸、亚铁氰化钾、乙酸锌、碳酸钠、磷酸二氢钾、碳酸 氢 钠 均 为 分 析 纯，国 药 集 团 化 学 试 剂 有 限 公 司；2,4二 硝 基 氟 苯（DNFB）阿 法 埃 莎-中 国 化 学 有 限公 司；实 验
20、 用 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品：氨 基 酸 配 方、乳蛋白深度水解配方、乳蛋白部分水解配方、氨基酸代 谢 障 碍 配 方 均 为 市 售；PTFE微 孔 滤 膜 0.22 m，上海安谱科学仪器有限公司。ACQUITY UPLC超 高 效 液 相 色 谱 仪 配备Wa-ters二 极 管 阵 列 检 测 器，美国Waters公 司；AB204-S型电子天平瑞士Mettler Toledo公司；SB-800DTD型 超 声 波 清 洗 器 中 国 宁 波 新 芝 生 物 科 技 股 份 有 限公司；3-18K型冷冻离心机德国Sigma公司；Milli-Q超 纯 水 制 备 器 美国M
21、ILLIPORE公 司；MS3涡旋混合器德国IKA公司。1.2标准溶液的配制 1.2.1 标 准 储 备 液 分 别 称取10 mg（精 确至0.1 mg）氨 基 酸 标 准 品，于25 mL棕 色 容 量 瓶 中，用0.1 mol/L盐酸溶液分别定容至刻度，配制成浓度均为0.4 mg/mL的标准储备液，04 避光保存。第 44 卷 第 14 期 尹丽丽，等：超高效液相色谱法检测特殊医学用途配方食品中22种游离氨基酸 265 1.2.2 标 准 工 作 溶 液 将 标 准 储 备 液用3.5%磺 基水 杨 酸 溶 液 逐 级 稀 释，配 成 各 组 分 浓 度为2、10、20、50、100 g
22、/mL的混合标准工作溶液。1.3样品前处理提 取：样 品 混 匀 后 称取0.2 g（精 确至0.0001 g）于50 mL聚 丙 烯 具 塞 离 心 管 中，准 确 加入25 mL 3.5%磺 基 水 杨 酸 溶 液，涡旋1 min，超声15 min。8000 r/min离心5 min，取上清液待衍生。衍 生：分 别 取 标 准 工 作 溶 液 和 样 品 提 取液200 L至15 mL离 心 管，加入0.5 mol/L碳 酸 氢 钠（pH9.0）200 L，涡 旋 混 匀 后 加入400 L 1%DNFB衍 生 液，混 匀 后 放入60 水 浴 振 荡 暗 反应10 min，取 出 放至
23、室 温，加入0.05 mol/L磷 酸 二 氢 钾（pH7.0）3 mL，涡 旋 混 匀。过0.22 m滤 膜 后，供 超 高 效 液 相 色 谱-二极管阵列检测器测定。1.4色谱条件色 谱 柱：ACQUITY UPLC HSS T3谱 柱（2.1 mm100 mm，1.8 m）；流 动 相：50%乙 腈 水（A）和50 mmol/L甲 酸 铵 溶 液（pH5.0）（B）。检 测 波 长：360 nm；流 速：0.3 mL/min。柱 温：55；进 样 量：3 L。梯 度 洗 脱 程 序（A）：06 min：12%18%，610 min：18%50%，1028 min：50%90%，28.13
24、3 min：100%保持，33.140 min：12%保持。1.5数据处理通过与仪器配套的Empower 3色谱数据处理系统进行数据采集与处理，Origin 8.0进行绘图。2结果与分析 2.1色谱条件的优化氨 基 酸 目 标 物 极 性 强，在 色 谱 柱 上 保 留 弱，需 衍生 后 测 定。碱 性 条 件 下，衍 生 化 试剂DNFB与 末 端氨 基 酸 反 应，脱 去 一 份子HF，生 成 具 有 紫 外 吸 收 的DNP肽（图1）。由于DNP肽 的 极 性 相 近，色 谱 保 留行 为 相 似，且 副 产 物 易 产 生 干 扰，使 得 色 谱 分 离 难 度增 加。为 此，本 文
25、对 色 谱 柱 和 流 动 相 条 件 进 行 详 细考察。2.1.1 色 谱 柱 的 选 择 常 规 液 相 色 谱 柱 粒 径 大、分析 效 率 低，为 实现22种 氨 基 酸 的 有 效 分 离，本 文 选用 柱 效 高、粒 径 小 超 高 效 液 相 色 谱 柱。采用1.4流动相条件，比较ACQUITY UPLC BEH Shield RP18、ACCQ-TAG ULTRA C18和ACQUITY UPLC HSST3三 种 色 谱 柱 的 分 离 效 果 发 现，Asn与 试 剂峰R1在 保 留 时 间 上 很 接 近，对 色 谱 柱 的 分 离 能 力 要 求 极高。Shield
26、RP18和ULTRA C18的 粒 径 小（1.7 m），理 论 柱 效 高，但 不 能 有 效 分 离出Asn，Asn被 试 剂 峰R1覆 盖，无 法 检 测；HSS T3（1.8 m）属100%水 性流动相兼容的C18色谱柱，专门用来保留和分离极性 FCOOHHN COOH HF+O2NNO2H2NR1R2O2NNO2R1R2pH9.010.0图 1 DNFB与氨基酸反应方程式Fig.1 Reaction equation of DNFB with amino acids 0.000.050.100.0000.0040.0080 10 200.0000.0050.0101234567890
27、1011+1213 14 1516171819202122R1R2R3a强度(AU)强度(AU)强度(AU)b时间(min)0 10 20时间(min)0 10 20时间(min)123456789 1011+1213141516171819202122c图 2 T3 柱分离22种氨基酸的色谱图Fig.2 Chromatograms of 22 amino acids separated by T3 column注：1-Asp；2-Glu；3-L-Hpy；4-Asn-；5-Ser；6-Gln；7-Gly；8-Cit；9-Arg；10-Thr；11-Ala；12-Pro；13-Val；14-Me
28、t；15-Cys；16-Ile；17-Leu；18-His；19-Phe；20-Orn；21-Lys；22-Lyr；0-Tau（类氨基酸，非本文目标物）；R-试剂峰；a：标准溶液；b：样品；c：加标样品。266 食品工业科技 2023年 7 月水 溶 性 好 的 有 机 小 分 子。图2为HSS T3柱 分 析 目标 物 的 色 谱 图（a、b、c分 别 为 标 准 溶 液、代 表 性 样品、样 品 加 标 的 谱 图），Asn保 留 时 间 位 于 试 剂 峰R1之 后，且 与 邻近Ser有 效 分 离；除 此 之 外，特 殊 医学 用 途 配 方 食 品 中 常 添 加 的 类 氨 基 酸
29、 成 分5Tau可同 时被DNFB衍 生，Tau与 邻 近 目 标 物 的 分 离 度 同样 影 响 着 目 标 氨 基 酸 的 准 确 定 量，图2a可 以 看 出，HSS T3柱能同时满足22氨基酸和Tau的有效分离。2.1.2 流 动 相 的 选 择 现 有 文 献 报 道 的 用 于 分 离DNP肽的流动相-水相常用磷酸盐缓冲液，其中需加入三乙胺等离子对试剂，配制过程复杂、使用过程中易 析 出 且 对 色 谱 柱、仪 器 均 不 友 好。本 文 尝 试 使 用溶 解 性 好 的 甲 酸 铵 作 为 水 相 分析DNP肽，一 方 面 简化 了 配 制 流 动 相 的 繁 杂 性，降 低
30、了 检 测 成 本；另 一 方面 该 试 剂 对 环 境 友 好 也 有 利 于 仪 器 或 色 谱 柱 寿 命 的延长。研究发现，乙腈水&甲酸铵的流动相体系中有机 相-乙 腈 浓 度 对 目 标 物 的 分 离 度 尤 其 敏 感，因 此 对有机相进一步考察。有 机 相-乙 腈 水 作 为 强 洗 脱 溶 剂，其 浓 度 直 接 影响 洗 脱 速 度，进 而 影 响 化 合 物 的 分 离 度，其中Ala、Pro两 峰、Ile、Leu、His三 峰 的 分 离 是 难 点（图3）。当 乙 腈 浓 度为100%时，目 标 峰 被 洗 脱 太 快，集 中 分布 在 色 谱 图 前 端，Ala、P
31、ro分 离 度 好，但Ile、Leu、His三 峰 明 显 分 不 开；当 乙 腈 浓 度为40%时，洗 脱 速度变慢，分析效率低，同时水相甲酸铵盐被稀释，浓度降 低，致 使 末端Leu、His分 离 度 差；当 乙 腈 浓 度 为60%时，目 标 氨 基 酸 分 布 相 对 均 匀，但 Ile、Leu、His三 峰 仍 分 不 开；当 乙 腈 浓 度为50%时（图2a），Ala、Pro两峰分离度稍差（定量为Ala、Pro之和），可以 通 过 光 谱 图 辅 助 定 性，其他20种 氨 基 酸 分 离 效 果满 意。因 此，本 文 选择50%的 乙 腈 水 作 为 有 机 相，50%乙 腈 水
32、&50 mmol/L甲 酸 铵 溶 液 为 最 终 流 动 相体系。2.1.3 特 征 吸 收 光 谱 定 性 讨 论 二 极 管 阵 列 检 测 器全波长同时采集数据的特点，赋予了其光谱比对的功能，衍 生 后 生 成的DNP肽 的 紫 外 吸 收 光 谱 形 状 类似，但 是 一 级 与 二 级 氨 基 酸 衍 生 后 形 成的DNP肽 光谱 特 征 差 异 明 显。一 级 或 二 级 氨 基 酸 是 针 对 氨 基 中N的 配 位 状 态 来 说 的，一 级 氨 基 酸 的 氨 基 为 伯 氨 基，二 级 的 氨 基 为 仲 氨 基，如Pro、L-Hpy。图4看 出，一级氨基酸衍生产物光谱
33、图最大吸收集中在3603 nm处，而 二 级 氨 基 酸（Pro、L-Hpy）的 最 大 吸 收 移至385 nm左 右。特 征 紫 外 吸 收 波 长 可 辅 助 定 性 一 级 氨 基 酸 和二级氨基酸，为后续推断更多化合物的结构与性质推断提供参考价值。2.2前处理条件考察 2.2.1 提 取 条 件 的 考 察 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 基质 复 杂，含 有 麦 芽 糊 精、蛋 白 质、脂 肪 及 维 生 素 等 各类 小 分 子 成 分，为 防 止 蛋 白 水 解 为 氨 基 酸，游 离 态 氨基酸需要在沉淀蛋白前提下提取，本文基于氨基酸配方 食 品 考 察 了 三 种
34、前 处 理 方 式：3.5%磺 基 水 杨 酸（E1）、亚铁氰化钾-乙酸锌（E2）和80%乙腈（E3），三种提取液均具有沉淀蛋白作用。图5柱状图比较发现，E1的提取效率明显高（其中 L-Hyp、Glu、Asn、Cit、Orn均 未 检 出）。E2和 0 1 15 20 25 300.000.050 1 15 20 250.000.050 1 8 10 12 140.00.1R322212019R2111213 141516 17+18 强度(AU)强度(AU)强度(AU)1112R2R313+142021221516+17+1819时间(min)时间(min)时间(min)R31112R213
35、14152221201916+17+18 100%40%60%图 3 有机相比例对22种DNP肽分离度的影响Fig.3 Effect of organic phase ratio on the separation degree of 22 amino acid derivatives注：11-Ala；12-Pro；13-Val；14-Met；15-Cys；16-Ile；17-Leu；18-His；19-Phe；20-Orn；21-Lys；22-Lyr；0-Tau；R：试剂峰。第 44 卷 第 14 期 尹丽丽，等：超高效液相色谱法检测特殊医学用途配方食品中22种游离氨基酸 267 E3虽 能
36、 较 好 地 沉 淀 滤 液，但 是 氨 基 酸 含 量 出 现 不 同程度的偏低现象，可能是二者在沉淀或者聚集过程中带走了部分氨基酸。进一步考察E1的回收率，发现其对22种氨基酸的回收率均满意。推测原因，E1一方 面 通 过 提 高 离 子 强 度，使 蛋 白 质 的 溶 解 度 降 低，从而 沉 淀 蛋 白；另 一 方 面 通 过 提 高 溶 液 酸 度，使 氨 基 酸的 溶 解 度 增 加，从 而 能 高 效 提 取 氨 基 酸。综 上，本 实验选择3.5%磺基水杨酸的提取方式。AspGluL-HypAsnSerGlnGlyCitArgThrAla+ProValMetCysIleLeuH
37、isPheOrnLysLyr0.00.51.01.5回收率(%)含量(g/100 g)E1 E3020406080100120 E2 E1图 5 提取条件的考察Fig.5 Examination of extraction conditions注：E1、E2、E3柱 状 图 代表3种 提 取 条 件 的 提 取 效 率；E1曲线图代表3.5%磺基水杨酸的回收率。2.2.2 衍 生 条 件 的 考 察 衍 生 条 件 是 否 充 分、副 产物 干 扰 等 因 素 都 会 影 响 目 标 氨 基 酸 的 准 确 定 量，因此，本文对衍生条件进行详细考察及优化。根据特殊医学用途配方食品中游离氨基酸的
38、含量范围，本着衍生剂过量且不干扰定量的原则，研究选用100 g/mL混 合 标 准 溶 液 考 察 衍 生 试 剂 的 最 佳 用 量，通 过 考 察DNFB的 不 同 用 量（0.1%、0.5%、1%、2%）对 氨 基 酸响 应 的 差 异 来 衡 量 衍 生 效 果。结 果（图6）表 明，DNFB含 量 与 衍 生 反 应 呈 正 相 关。当DNFB含 量为0.1%时，目标峰响应明显低，衍生不充分；当含量为0.5%时，仅6种（Ser、Gln、His、Orn、Lys、Lyr）氨 基 酸 响 应 低；当 含 量 增至1%时，各 氨 基 酸 响 应 不再增加；当含量增至2%时，衍生试剂的峰宽增大
39、，反而 干 扰 附 近 氨 基 酸 的 准 确 定 量，检 测 成 本 也 随 之 增加。综 合 考 虑，选择1%含 量的DNFB作 为 衍 生 试 剂。据 相 关 文 献 报 道1618，衍 生 条 件有30、60 min恒 温，衍 生 时 间 较 长。本 文 比 较 不 同 衍 生 时 间（0、10、20、30 min），在60 水 浴 振 荡 条 件 下 的 反 应，记 录 氨 基 酸 含 量 的 变 化 发 现，衍 生 时 间为0 min时，无 目 标 衍 生 产 物，衍生10、20、30 min后，衍 生 产 物的响应基本一致，随着时间的延长，响应无明显变化，说明60 水浴振荡条件下
40、衍生10 min即反应完全。2.3方法学评价 2.3.1 线 性 范 围、检 出 限 和 定 量 限 将 系 列 标 准 工作 溶 液（2、10、20、50、100 g/mL）由 低 到 高 依 次 测定，以每种氨基酸峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，g/mL）为 横 坐 标 绘 制 标 准 曲 线。结 果 显 示，22种 氨基 酸在2100 g/mL范 围 内，线 性 回 归 方 程 及 相 关系 数 如表1所 示。采 用 部 分 水 解 配 方 作 为 空 白 基 质加 标 的 方 法，以 信 噪比S/N=3得 到 检 出 限（LOD）为10 mg/100 g，以 信 噪比S/N=10得
41、 到 定 量 限（LOQ）为25 mg/100 g。表 1 22种氨基酸线性回归方程及相关系数Table 1 Linear regression equations and correlationcoefficients of 22 amino acids化合物 线性回归方程决定系数（R2）Asp Y=1.708878e+003X7.160395e+002 0.9984Glu Y=1.565137e+003X+6.428316e+002 0.9997L-Hyp Y=1.922419e+003X1.649680e+002 0.9994Asn Y=1.699338e+003X+2.475664e+
42、002 0.9999Ser Y=1.641198e+003X+1.222909e+002 0.9998Gln Y=1.552204e+003X8.413360e+002 0.9986Gly Y=1.639792e+003X+1.033586e+002 0.9999Cit Y=1.074429e+003X+3.671412e+002 0.9958Arg Y=1.672074e+003X+1.735269e+002 0.9998Thr Y=1.686861e+003X+4.566290e+002 0.9998Ala+Pro Y=1.288069e+003X+3.513061e+002 0.9999
43、Val Y=1.689239e+003X+4.548071e+002 0.9999Met Y=1.501528e+003X6.406490e+002 0.9991Cys Y=1.479431e+003X+1.628040e+002 0.9999Ile Y=1.721529e+003X+7.216248e+002 0.9999Leu Y=1.711149e+003X+6.272788e+002 0.9999His Y=2.124532e+003X1.404751e+002 0.9998Phe Y=1.501713e+003X+3.245993e+002 0.9999Orn Y=1.261322e
44、+003X7.980346e+002 0.9959Lys Y=2.559017e+003X2.071023e+003 0.9996Lyr Y=1.130975e+003X1.850230e+003 0.9995 2.4回收率及精密度实 验 采 取 某 氨 基 酸 配 方 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品 300 400 5000.000.020.040.06强度(AU)AspGluL-HypAsnSerGlnGlyCitArgThrProAlaValMetCysIleLeuHisPheOrnLysLyr385 nm(nm)图 4 22种DNP 肽的光谱图Fig.4 Spectrogram
45、s of 22 amino acid derivatives 0200000400000600000800000峰面积 0.1%0.5%1%2%AspGluL-HypAsnSerGlnGlyCitArgThrAla+ProValMetCysIleLeuHisPheOrnLysLyr图 6 衍生试剂用量的考察Fig.6 Examination of derivative reagent dosage 268 食品工业科技 2023年 7 月进 行 回 收 率 试 验，添 加 含 量为50、250和500 mg/100 g三 水 平 的 标 准 溶 液，每 个 水 平 平 行 测定6次，得 到 方
46、法 的 回 收 率 及 精 密 度，结 果 见表2。结 果 显 示，回 收率在90.1%109.1%之 间，相 对 标 准 偏 差为0.8%6.9%。2.5实际样品的测定运 用 本 方 法 对 市 售 部 分 水 解 配 方（F1）、深 度 水解 配 方（F2）、氨 基 酸 配 方（F3）和 氨 基 酸 代 谢 障 碍 配方（F4）特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品中22种 游 离 氨 基 酸进行测定，结果显示四种配方均未检出可能非法添加的L-羟脯氨酸；部分水解配方未检出其他21种游离氨 基 酸；深 度 水 解 配 方 未 检出Gln、Cit和Orn；氨 基酸 配 方 未 检出Glu、As
47、n、Cit和Orn；氨 基 酸 代 谢 障碍 配 方 未 检出Glu、Asn、Cit、Phe和Orn，其 他 检 出成分含量见表3。结果表明，部分水解配方不含游离氨基酸，深度水解配方、氨基酸配方和氨基酸代谢障碍配方中含有大量游离氨基酸，氨基酸配方和氨基酸代谢障碍配方中检出的氨基酸种类与配料表相符。表 3 特殊医学用途配方食品中22 FAAs含量Table 3 Content of 22 FAAs in special medical formula foods化合物 F1（g/100 g）F2（g/100 g）F3（g/100 g）F4（g/100 g）Asp ND 0.158 1.302 1
48、.196Glu ND 0.826 ND NDL-Hyp ND ND ND NDAsn ND 0.910 ND NDSer ND 0.502 0.791 0.621Gln ND ND 1.150 1.215Gly ND 0.102 0.453 0.226Cit ND ND ND NDArg ND 0.645 0.667 0.402Thr ND 0.527 0.828 0.495Ala+Pro ND 0.332 1.221 0.699Val ND 0.767 1.273 0.527Met ND 0.412 0.291 0.143Cys ND 0.516 0.812 0.411Ile ND 0.68
49、0 0.889 0.546Leu ND 0.856 1.025 0.662His ND 0.294 0.459 0.221Phe ND 0.680 0.671 NDOrn ND ND ND NDLys ND 1.149 0.882 0.592Lyr ND 0.151 0.528 0.331注：ND 表示未检出。3结论本 文 建 立 了 特 殊 医 学 用 途 配 方 食 品中22种 游离氨基酸的检测方法，方法详细考察了提取、衍生及色 谱 条 件，发 展 了 分离DNP肽 的 绿 色 色 谱 条 件，缩短 了 衍 生 时 间、提 高 了 检 测 效 率。22种 氨 基 酸 在2100 g/mL范
50、 围 内 线 性 关 系 良 好（R20.99），检 出限为10 mg/100 g，定 量 限为25 mg/100 g，加 标 回 收率为90.1%109.1%，相 对 标 准 偏 差为0.8%6.9%。方法针对特殊医学配方食品基质，采用磺基水杨酸沉淀蛋白、去除干扰杂质；选用超高液相色谱法提高检测效率、降低成本；首次使用乙腈水-甲酸铵流动相条 表 2 22种游离氨基酸回收率与精密度结果（n=6）Table 2 Recovery and precision results of 22 free amino acids(n=6)化合物 添加量（mg/100 g）平均回收率（%）精密度（%）Asp5
