1、1第四章 寄生虫及寄生虫病研究新技术、方法当今科学技术快速发展，多种学科和新兴领域相继涌现，不断产生新的交汇点和生长点，从中引发出重大科学问题，逐渐形成了现代医学的前沿领域，这些领域的研究成果已成为寄生虫学发展的重要推动力。将医学前沿研究与寄生虫病防治实践相结合，始终是寄生虫学工作者关注和工作的重点。本章节简要介绍分子生物学和免疫学的一些前沿领域研究的新技术和新方法,为寄生虫病研究提供新思路。一、分子生物学1基因组学和后基因组学的研究人类基因组研究计划（Human Genomic Project , HGP）于 1990 年正式开始实施，主要科学目标是研究基因组的结构，绘制遗传连锁图、物理图、
2、序列图和转录图。近年来寄生虫基因组的研究已经开始，其中疟原虫和溶组织阿米巴基因组计划已宣布全部完成。血吸虫，包虫等还在进行中。主要内容有新基因的发现，物理图谱的制作，cDNA 微型矩阵的制作，线粒体基因的测序以及生物信息学的研究等。应用于血吸虫基因组计划研究采用的主要技术有荧光原位杂交（FISH） ，表达序列标签（EST） ，DNA 芯片微阵技术（chip microarray） 。随着基因组计划的即将完成，目前已开始进入“后基因组学”时代，即识别和鉴定基因组的功能信息。后基因组学研究内容主要有：基因的识别和鉴定以及基因功能信息的提取和鉴定。目前识别基因的生物学手段主要基于以下原理和思路：根据
3、已知基因序列资料。根据可表达序列标签（EST） 。对染色体特异性 cosmid 进行直接的 cDNA 选择。根据 CpG 岛。差异显示及相关原理。外显子捕获及相关原理。DNA 微芯片技术。该技术可用于任何位点基因突变、缺失和插入等的鉴定，感染性疾病和肿瘤的检测，易患倾向基因的检测，新基因的发现，基因作图和基因表达研究等方向。DNA 芯片技术在蚊虫2抗性基因和疟原虫耐药基因的研究等项目中已经应用。基因组扫描。突变检测体系。基因功能信息的提取可采取下列方法：绘制基因图，包括所有的基因及等位基因，系统鉴定基因突变体。绘制基因表达谱，采用微点阵技术（microarray） 、定量 PCR、原位杂交及计
4、算机参与，用于定量分析基因表达水平。基因敲除（gene knock out）或转基因动物的建立，用以检测模式生物的生物学功能改变，这是了解特定基因功能的重要途径之一。探测蛋白质水平、修饰状态和相互作用。采用双向凝胶电泳和质谱法相结合，并通过蛋白质数据库比较的方法识别蛋白质片段，检测磷酸化和糖基化二级修饰。采用 DNA 靶检测技术，构建基因组相互作用图。采用 X 线衍射技术和核磁共振技术对蛋白质进行空间构型分析，以研究蛋白质结构与功能的关系，并判断相关基因的结构与功能关系。采用显微镜定位定量技术和 FISH、Confocal 等新技术对蛋白质的结构与功能及相互作用进行分析，以了解基因的结构与功能
5、的关系。其它应用的方法还有酵母人工染色体（YAC） 、聚类分析技术（cluster analysis） 、细菌人工染色体（BAC） 、猎枪测序法（shotgun sequencing） 、序列标签位置（STS）等。2细胞凋亡细胞凋亡（apoptosis）与细胞坏死性死亡意义不同，凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，遵循自身的程序，结束生命的过程。已经发现三类细胞凋亡相关基因，即在细胞凋亡过程中表达的基因，促进细胞凋亡的基因和抑制细胞凋亡的基因。已经证实细胞凋亡过程是受基因调控的，是主动连续的程序化反应。利用分子生物学和细胞生物学的新技术，从分子水平上深入揭示细胞凋亡的启动、发生和发展规律，可
6、研究寄生虫在人体内的发育，宿主的免疫防御，超敏反应等机制。最近日本血吸虫虫卵肉芽肿的细胞凋亡研究已经开始。一般说来，细胞凋亡的测定方法可分为形态学、生物化学、免疫化学、组织化学和分子生物学的方法，其中分子生物学方法灵敏度高，在细胞凋亡研究中被广泛采用。由于细胞凋亡中染色体 DNA 断裂是个渐进的、分阶段的过程，染色体 DNA 首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为 50300kb 的大片段，然后约 30%的染色质 DNA 在 Ca+、Mg +依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成 180200bp 核小体 DNA 多聚体。DNA 双链断裂或某一条链上出现缺口而产生的一系列 D
7、NA 的 3-OH 末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、硷性磷酸化物酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 的 3-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL） 。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂，因而没有33-OH 形成，很少能够被染色。低分子量的 DNA 分离后，也可使用 DNA 聚合酶进行缺口翻译（nick translation） ，使低分子量的 DNA 标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL 或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完
8、整的单个凋亡细胞或凋亡小体进行原位染色，能准确地反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征，不仅可检测出极少量的凋亡细胞，而且可用于进行石蜡包埋或冰冻的组织切片以及新鲜的或体外培养的组织的细胞凋亡测定。3糖生物学糖类是自然界中分布最广的有机分子，除了简单的多糖外，糖类还和许多其它生物分子形成复合物。复合糖类根据其组分可分为糖蛋白、蛋白聚糖和糖脂、脂多糖等类型。复合糖类存在于寄生虫细胞表膜、细胞间质和多种循环分泌排泄物中。核酸也是一种复合糖，因为核酸的骨架就是核糖链和脱氧核糖链。在细胞质和细胞核内发现了一种新的糖基磷脂酰肌醇化蛋白，GPI(glycosylphosphatidylinositol)，
9、在曼氏血吸虫 Sm23 成虫表膜以及许多原虫表面抗原，如锥虫表膜抗原变异体（VSG） 、疟原虫裂殖体的表面抗原和蛋白酶中均已检出。目前研究较多的是糖蛋白，蛋白中的糖链和肽链的连接方式有两种：N-糖苷键和 O-糖苷键。曼氏血吸虫循环阴极抗原（CCA）存在 N-糖苷链，而循环阳极抗原(CAA)不存在 N-糖苷链。曼氏血吸虫雄虫合成的糖蛋白含有 O-糖苷链。开展糖生物学研究，首先要检测糖复合物的存在并进行组分分析，糖复合物的检测包括糖部分和非糖部分。糖类的检测比蛋白质和核酸更为复杂，这是因为糖类没有特征的吸收光谱，不能用分光光度法进行检测。糖类的检测通常都是利用特殊的化学反应使糖类显色，然后再比色测
10、定。但是即使是简单的单糖因其所含羟基的不同和其它取代基的存在，也无法用统一方法进行检测。要了解糖复合物的结构和功能以及进一步研究其合成和调控，还需应用糖复合物的分离纯化技术，对其组成分析和测定后方可测定各个组分的结构，不但要测定糖链的结构，还需了解糖链和非糖部分的连接情况，尤其是糖蛋白。糖类复合物和其它生物分子一样，只有在和其它分子相互作用时，才能体现它们的功能，因此功能研究应包括糖链的相互作用以及作用中的其它非糖类的重要成分。最终可用改造糖链结构和糖基化工程制备糖复合物。这一方面的研究虽然刚刚起步，但发展趋势令人注目，为糖复合物的疫苗和药物研制提供了一条新途径。二、免疫学4近 30 年来，免
11、疫学获得巨大发展，并取得了许多突破性成果。免疫学对寄生虫学的渗透和交叉又推动了寄生虫病防治工作，在寄生虫病免疫学诊断和疫苗研究以及寄生虫感染的免疫病理研究方面均取得重大成果。这里简单介绍近年来新发展的一些免疫学技术和方法。1细胞因子测定随着越来越多的细胞因子基因克隆和功能应用研究的深入，细胞因子检测从早期的非特异生物活性检测发展到特异生物活性检测，这一技术在寄生虫病机制研究及流行病学调查中得到迅速的发展。细胞因子检测可应用于：反映机体免疫状态，判断疫苗接种后宿主产生细胞免疫的状态及效果。分析细胞因子在机会感染寄生虫致病患者中的疗效，分析流行社区人群中细胞免疫状况及其在免疫力产生中的作用和影响。
12、分析细胞因子的药化动力学及毒性剂量，确定应用剂量；判断细胞因子作为佐剂的免疫增强效应。分析寄生虫感染免疫性疾病的发病过程中活化应答 T 细胞克隆的细胞因子种类。寄生虫感染宿主细胞表面细胞因子受体类型及亲和性。细胞因子的定量检测，不仅可了解免疫功能状态，而且涉及寄生虫病的发生、发展、治疗、转归及预后。细胞因子检测方法可分为三类：生物活性检测，免疫学检测，分子杂交检测。检测原则一般为多种细胞因子同时检测，检测局部细胞或局部部位产生或存在的细胞因子，动态检测至少应采集双相（急性期/慢性期，治疗前后）标本对照检测，多种方法同时应用。生物活性及免疫学检测方法已有很多专著，此处仅介绍分子杂交的基本原则。分
13、子杂交的基本原则是检查细胞内细胞因子 mRNA 或 cDNA，应用细胞因子标记探针与细胞的 mRNA 或 DNA 进行 DNA-RNA(Northern blot)杂交或 DNA-DNA(Southern blot)杂交，能杂交显带者，则证明该细胞有细胞因子基因。2抗体制备技术人们很早就发现抗体具有中和毒素的功能并可用于治疗感染性疾病，但抗体治疗并未获得人们期望的进展。第一代多克隆抗体主要来源于免疫动物，1975 年第二代抗体即用细胞工程技术制备的鼠源单克隆抗体问世，在生命科学研究及体外诊断方面发挥了重大作用并已形成产业，但在体内应用仍不理想。鼠源单抗反复使用会诱导机体产生人抗鼠抗体，改变抗体
14、的合理分布及疗效，并可能引起过敏反应。而且鼠抗体分子量过大，难以渗透进入靶目标或通过血脑屏障。因此 20 世纪 80 年代中期开始第三代基因工程抗体的研制。用分子生物学技术改造鼠源抗体实现人源化，如人-鼠嵌合抗体和改型抗体的制备。也可5制备小分子抗体，如 Fab、Fv 和单链抗体（SFv） 。近年发展的抗体库技术使人源抗体制备获得突破。抗体库技术系指用基因克隆技术将全套抗体重链及轻链可变区基因克隆出来，重组到原核表达载体，通过大肠杆菌直接表达有功能的抗体分子片段，最后筛选到特异的可变区基因。抗体库技术应用了新发展的 PCR 技术，用一组引物即可克隆出全套抗体的可变区基因。另一项突破技术是大肠杆
15、菌成功表达分泌型抗体分子片段。目前应用的有组合抗体库技术和噬菌体抗体库技术。另外用基因工程方法还可制备双特异抗体（bispecific antibody, BsAb） ，又称双功能抗体（bifunctional antibody） 。BsAb 与天然抗体有许多不同之处，它可同时与两种抗原发生反应并使之交联，可使某种效应因子定位于靶细胞，是制备免疫毒素（immnotoxin）俗称生物导弹的重要技术。过去用化学交联或细胞工程方法制备 BsAb，但难以达到应用阶段。而基因工程 BsAb，采用小抗体分子片段如 Fab、Fv或 ScFv，经基因操作在体外或细胞内组装，直接表达 BsAb。国内在日本血吸虫
16、疫苗候选分子单克隆抗独特型抗体的人源化改造研究已经起步。3寄生虫病免疫诊断技术发展趋势寄生虫感染的确诊一般应依靠病原学诊断。有些组织寄生虫病原诊断较困难，必须发展分子或免疫诊断技术。由于病原学检查耗时耗力，一般不适于现场大规模普查，加之多年防治工作的实施，寄生虫感染度明显降低，而病原学检测在低感染中敏感性较差，因此需要简便快速准确的免疫学检测方法。免疫学方法在寄生虫病诊断中已广泛应用，但此类方法仅能作为辅助诊断工具。目前应用最多的是抗体检方法，此类方法敏感性和特异性较好，但缺点是治疗后抗体仍长期存在于宿主血清中，难以区别现症感染与既往感染。近年来迅速发展的有疗效考核价值的循环抗原检测和短程抗体
17、检测方法已开始用于寄生虫病诊断。下面简述寄生虫病免疫诊断技术发展趋势： 单克隆抗体（MAb）将完全或部分取代多克隆抗血清，因为 MAb 具有特异性强，只与抗原分子上某一抗原决定簇结合，质地始终如一，重复性好；可用少量不纯抗原、全细胞和组织粗提物作为免疫原；以及可大批量生产等优点。 将用 Fab或 F(ab)2片段而不是整分子 IgG，因为片段可除外 Fc 的干扰，进一步提高检测的特异性。 双抗体夹心 ELISA 引入放大系统可使敏感度提高 10100 倍。 双特异抗体（BsAb）和抗独特型抗体（anti-idiotypic antibody） ，重组抗原，肽抗原等将更多地用于寄生虫病免疫诊断。 定量技术的发展，有助于提高诊断和基础研究水平。快速诊断技术如金标渗滤法，6试条法（Dip-stick）有助于 ELISA 进入家庭自我检测。 无损伤性检测如尿液、唾液、粪便中的抗原或抗体检测技术将从实验室研究进入现场应用。 自动化、标准化、操作程序的发展有助于提高诊断效率和获取结果的客观化。 单一功能的免疫诊断技术正在发展中并逐渐应用于临床和现场，如能考核疗效，确定虫荷，评估疫苗接种效果，预测发病的相关指标，提示免疫力水平等等。（管晓虹）
