1、转基因玉米和转基因大豆盲样检测方法 李丽娜 金龙国 谢传晓 刘昌林 中国农业科学院作物科学研究所 摘 要： 转基因作物商业化发展迅速, 中国每年进口大量转基因产品并高度重视我国转基因作物研发, 制定了转基因作物及其产品的监管制度。现实迫切需要一套简单、可靠的盲样转基因成分检测方法。该研究以转基因大豆盲样 (W160982 和W160984) 和转基因玉米盲样 (W160983 和 W160985) 为研究材料, 根据农业部的转基因检测标准, 采用普通 PCR 技术对作物中转基因成分进行检测。通过与标准样品比对并测序, 最终确定盲样的转基因成分, 玉米盲样 W160983 转基因成分与标准品 M
2、ON89034 一致, W160985 与 TC1507 一致;大豆盲样 W160984 与BPS-CV127-9 一致, W160982 与 GTS40-3-2 一致。该研究提供并验证了一套玉米和大豆转基因盲样检测的方案, 在转基因作物研究生产、进出境检测、监管等方面具有实际应用价值。关键词： 转基因玉米; 转基因大豆; 盲样; 转基因成分; 检测; 聚合酶链式反应 (PCR) ; 作者简介：李丽娜, 在读硕士, 主要从事玉米分子育种研究工作作者简介：刘昌林, 通信作者, 助理研究员, 研究方向是转基因作物环境安全评价与玉米遗传育种收稿日期：2017-07-03基金：基金项目:养分高效利用转
3、基因玉米新品种培育 (2016ZX08003005) Determining Blind Samples of Transgenic Maize and Transgenic SoybeanLi Lina Jin Longguo Xie Chuanxiao Liu Changlin Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences; Abstract： Genetically modified crops developed rapidly in the world. China imports a lar
4、ge amount of products of genetically modified crops every year, and has put billions of money in genetically modified crops research. China also has established regulations for genetically modified crops and their products. Simple and reliable methods for detecting transgenic ingredients are very ur
5、gent in China. In this study, according to the detection protocols of genetically modified crops published by the Ministry of Agriculture of the Peoples Republic of China, blind samples of soybean (W160982 and W160984) and maize (W160983 and W160985) were detected for transgenic ingredients using th
6、e PCR technology. As a result, W160983, W160985, W160982, and W160984 are the standard sample MON89034, TC1507, GTS40-3-2, and BPS-CV127-9, respectively. The results of the blind samples were validated by sequence alignment of the PCR product. This study provided an experimental protocol for the det
7、ection of transgenic maize and soybean.Keyword： Transgenic maize; Transgenic soybean; Blind sample; Polymerase chain reaction; Received： 2017-07-03转基因是利用现代生物技术将人工分离的基因转到受体生物, 使重组生物增加人们所期望的新性状, 培育出新品种。随着转基因技术的不断发展, 转基因产品凭借其巨大的品种优势和经济效益, 呈现出较好的发展趋势。截至 2016 年, 全球 26 个国家种植转基因作物, 全球转基因作物的种植面积从 1996 年的 17
8、0万 hm 增加到 1.851 亿 hm, 增加了近 110 倍, 21 年间 (1996-2016 年) 转基因作物的商业化种植面积累计达到了 21 亿 hm21。全球转基因大豆的种植面积最大, 为 9 140 万 hm, 而中国消费了全球大豆产量的约 1/3, 大豆进口量占全球大豆进口的 65%, 其中 90%以上为转基因大豆2。玉米作为全世界总产量最高的粮食作物, 其转基因品种种植占种植总面积的 26%以上3。我国是玉米生产和消费大国, 播种面积、总产量和消费量仅次于美国4, 我国每年需进口大量玉米, 其中多数 (90%以上) 为转基因玉米1。随着转基因产品的大量生产和国际贸易的加强,
9、转基因作物的生物安全性备受关注。基因漂移是生物安全的问题之一5, 转基因作物可能通过与近缘野生种杂交而使目标基因进入野生植物。如果外源基因的表达使植物具有繁殖优势, 如抗除草剂、抗霜冻等特性, 则可能导致自然生态系统失衡, 影响生物的遗传多样性;如果这种基因漂移到杂草, 则可能产生难以控制的杂草6。考虑到这些转基因作物的安全性问题, 中国、欧盟、日本等针对转基因作物均出台了相应的检测监管政策。我国 1993 年发布了基因工程安全管理方法, 对在我国境内开展的基因工程试验提出了明确规定;1996 年发布了农业生物基因工程安全管理实施方法, 2001 年出台了农业转基因生物安全管理条理7, 以加强
10、管理农业转基因生物, 保障人类、动物、植物、微生物安全, 保护生态环境。为了保障消费者自由选择的权利, 2002 年 3 月 20 日开始施行农业转基因生物标识管理办法, 要求凡在中国境内销售的列入标识目录的转基因产品必须进行标识。2015 年新修订的中华人民共和国食品安全法规定, 生产经营转基因食品应当按照规定显著标示, 并赋予了食品药品监管部门对转基因食品标示违法违规行为的行政处罚职能。中国每年进口大量玉米、大豆, 而未经批准的违规转基因成分可能出现在进口农作物产品中。2010 年, 美国出口到中国的转基因玉米被深圳出入境检验检疫局检测出未经批准的转基因成分后退回8。面对转基因作物研究、生
11、产、贸易和消费市场, 迫切需要规范转基因监督管理, 而转基因监督管理的先决条件是转基因成分的检测, 因此, 建立快速、准确的转基因成分检测方法具有非常重要的意义。转基因成分检测主要是针对未标示、不明确的转基因样品, 通过分子生物学等方法进行检测, 其中, PCR 方法是适应性最广、灵敏度较高、技术较成熟的一种核酸检测法。本研究以两份转基因玉米盲样和两份转基因大豆盲样为研究对象, 采用常规 PCR 检测方法, 将 PCR 产物与标准品对比, 并结合测序信息进一步验证 PCR 扩增结果, 形成一套科学、准确的转基因玉米和大豆盲样检测方案, 在转基因作物进出境检测、安全监管等方面提供技术支撑。1 材
12、料与方法1.1 试验材料转基因标准品购自上海佑隆生物科技有限公司, 转基因玉米、大豆盲样为从标准品中随机抽取的样品。玉米阴性对照为非转基因玉米掖 478, 大豆阴性对照为非转基因大豆蒙豆 12, 均由中国农业科学院玉米基因编辑与分子育种创新研究组提供。1.2 试剂与引物植物基因组 DNA 提取试剂购自国药集团化学试剂北京有限公司, 常规 PCR 试剂购自 Gen Star 康润生物公司, DNA 分子量标记以及凝胶回收试剂盒购自天根生化科技 (北京) 有限公司。PCR 采用的一套引物 (表 1) 参照转基因检测标准由北京六合华大基因科技有限公司合成。表 1 玉米和大豆的转基因检测 PCR 引物
13、 Table 1 PCR primers for detecting transgenic ingredients in maize and soybean 下载原表 表 1 玉米和大豆的转基因检测 PCR 引物 Table 1 PCR primers for detecting transgenic ingredients in maize and soybean 下载原表 1.3 试验方法1.3.1 对照的设置检测过程按照 GB/T 19495.2 的规定设置阳性对照、阴性对照和空白对照。1.3.2 玉米和大豆基因组 DNA 的提取及制备玉米总 DNA 的提取采用 CTAB 法34, 大豆
14、总 DNA 的提取采用改良的 CTAB 法35。用紫外分光光度计测定提取的 DNA 浓度及纯度, 并在 1%的琼脂糖凝胶上电泳检测 DNA 质量, 用 dd H2O 将 DNA 溶液稀释到 50ng/L, 在-20冰箱保存。1.3.3 PCR 检测PCR 扩增采用 20L 反应体系:2Taq PCR Star Mix with Loading Dye 10L, 正向引物和反向引物 (10mol/L) 各 1L, dd H 2O 7L, 模板 DNA 1L (50ng/L) 。PCR 扩增条件为:94变性 5min;94变性 30s, 56 (或 58、或 60, 根据具体的检测标准) 退火 3
15、0s, 72延伸 30s, 35 个扩增循环;72延伸 5min, 12保存。PCR 扩增结束后, 用电泳缓冲液 (1TAE) 制备 2%琼脂糖凝胶, 取8L PCR 产物进行电泳, 用 M5 DL2000 DNA Marker 作相对分子质量标记。在120V、200m A 条件下电泳 2040min, 用凝胶成像系统成像。1.3.4 序列测定参照 Axy Prep DNA 凝胶回收试剂盒使用说明对 PCR 产物 (目的条带) 切胶回收, 并将阳性对照与标准对照一起送往英潍捷基 (上海) 贸易有限公司进行测序, 采用 DNAMAN 对测序结果进行比对分析。2 结果与分析2.1 DNA 提取紫外
16、分光光度计检测结果 (图 1) 表明, 提取的 DNA 质量较好, OD 260/OD280在1.82.0, 电泳检测的条带均为清晰的单一条带, 符合 PCR 分析检测要求。图 1 转基因玉米和转基因大豆基因组 DNA 电泳检测 Fig.1 Gel electrophoresis detection of genome DNA extracted from transgenic maize and transgenic soybean 下载原图2.2 盲样检测利用检测转基因玉米的 14 对引物对两个转基因玉米盲样进行检测, 结果显示盲样 W160983 在图 2-的 10 号泳道显阳性, 其
17、PCR 产物大小与预期大小 207bp基本一致, 推断 W160983 的转基因成分是 MON89034;盲样 W160985 在图 2-的1 号泳道显阳性, PCR 产物大小与预期大小 279bp 基本一致, 推断是 TC1507。图 2 玉米转基因成分检测 Fig.2 Detection of transgenic ingredients in maize 下载原图M 为 DL2000 Marker, B 为空白对照, N 为阴性对照, 下同。:ae 组分别表示对转基因成分 MON88017、GA21、MIR604、MON8746、MON89034 的检测;:ae组分别表示对转基因成分 M
18、IR162、MON810、MON863、Bt176、DAS40278-9 的检测;:ad 组分别表示对转基因成分 TC1507、3272、59122、NK603 的检测。1、3、5、7、9 是 W160985 样品, 2、4、6、8、10 是 W160983 样品 M:marker DL2000;B:blank control;N:negative control, the same below.:a-e.detections of MON8801, GA21, MIR604, MON87460, MON89034 transgenic ingredients;:a-e.detections
19、of MIR162, MON810, MON863, Bt176, DAS40278-9 transgenic ingredients;:a-d.detections of TC1507, 3272, 59122, NK603 transgenic ingredients.1, 3, 5, 7, 9:W160985, 2, 4, 6, 8, 10:W160983利用转基因大豆检测标准的 9 对引物对两个转基因大豆盲样 W160982 和W160984 进行检测, 结果显示 W160982 在图 3-的 1 号泳道显阳性, 其 PCR 产物大小与预期大小 370bp 基本一致, 推断 W1609
20、82 的转基因成分是 GTS40-3-2;W160984 在图 3-的 4 号泳道中显阳性, PCR 产物大小与预期大小 238bp 基本一致, 推测是 BPS-CV127-9。2.3 内源基因检测与目的基因验证对玉米标准品和盲样的总 DNA 进行内参基因 z SSIIb 的扩增, 发现除空白对照外, 其他所有样品均能扩增出 151bp 大小一致的条带 (图 4-) 。对大豆标准品和盲样进行内参基因 Lectin 的检测, 所有样品均能扩增出 210bp 大小一致的条带 (图 5-) 。证明以上材料 DNA 提取质量高, PCR 体系稳定, 适合进行转基因检测。用转基因标准品与盲样检测中呈阳性
21、的 PCR 产物对比, 验证结果的准确性。图4-的 1 号泳道 (W160985) 与阳性对照 (TC1507) 在同一位置上有相同条带, 证明上一步转基因的检测结果正确;图 4-的 2 号泳道 (W160983) 与阳性对照 (MON89034) 一致。图 5-的 1 号泳道 (W160982) 与阳性对照 (GTS40-3-2) 一致;图 5-的 2 号泳道 (W160984) 与阳性对照 (BPS-CV127-9) 一致。2.4 测序验证图 6 为扩增良好且大小与目标片段相同的 PCR 产物 (阳性对照) 的序列对比结果, 显示盲样检测推断完全正确。图 3 大豆转基因成分检测 Fig.3
22、 Detections of transgenic ingredients in soybean 下载原图:ae 组分别表示对转基因成分 GTS40-3-2、MON89788、MON87701、MON87705、MON87708 的检测;:ad 组分别表示对转基因成分 MON87769、BPS-CV127-9、305423、356043 的检测。1、3、5、7、9是 W160982 样品, 2、4、6、8、10 是 W160984 样品:a-e.detections of GTS40-3-2, MON89788, MON87701, MON87705, MON87708 transgenic
23、ingredients;:a-d.detections of MON87769, BPS-CV127-9, 305423, 356043 transgenic ingredients.1, 3, 5, 7, 9:W160982 samples, 2, 4, 6, 8, 10:W160984 samples图 4 玉米样品目的基因的检测与内参基因 z SSIIb 的验证 Fig.4 Detections of transgenic ingredients and the internal reference gene z SSIIb in maize 下载原图S 是阳性对照 (S1:TC1507
24、, S2:MON89034) , 1:W160985, 2:W160983。为内参基因 z SSIIb 的检验结果;为 W160985 目的基因 (TC1507) 的验证, 为W160983 目的基因 (MON89034) 的验证 S:positive control (S1:TC1507, S2:MON89034) , 1:W160985, 2:W160983.:maize endogenous gene (z SSIIb) amplification;:confirmation of target gene TC1507;:confirmation of target gene MON89
25、034图 5 大豆样品目的基因的检测与内参基因 Lectin 的验证 Fig.5 Detections of transgenic ingredients and the internal reference gene Lectin in soybean 下载原图S 是阳性对照 (S1:GTS40-3-2, S2:BPS-CV127-9) 。1:W160982, 2:W160984。为内参基因 Lectin 的检验结果;为 W160984 目的基因 (BPS-CV127-9) 的验证, 为 W160982 目的基因 (GTS40-3-2) 的验证 S:positive control (S1:
26、GTS40-3-2, S2:BPS-CV127-9) .1.W160982, 2.W160984.:soybean endogenous gene (Lectin) amplification;:confirmation of target gene BPS-CV127-9;:confirmation of target gene GTS40-3-2图 6 序列比对结果 Fig.6 Sequence comparison 下载原图方框指示引物序列。为 MON89034 与 W160983 的序列比对结果, 为 TC1507与 W160985 的序列比对结果, 为 GTS40-3-2 与 W16
27、0982 的序列比对结果, 为 BPS-CV127-9 与 W160984 的序列比对结果 The box indicates the primer sequence.:the sequence comparison of MON89034 and W160983;:the sequence comparison of TC1507 and W160985;:the sequence comparison of GTS40-3-2 and W160982;:the sequence comparison of BPS-CV127-9 and W1609843 结论与讨论转基因检测技术是转基因作
28、物研究生产和安全管理的重要基础和技术保障。一方面, 研究过程中需要一套高效准确的检测技术去鉴定转基因植株并筛选稳定遗传的后代, 对培育出的转基因作物进行多方面的安全性评价;另一方面, 针对当前转基因作物商业化发展迅速、种植面积不断增加、品种日益丰富的现状, 转基因检测对于相关产品的安全监管是非常必要的。转基因安全管理部门以及监测机构需要严格规范的转基因检测技术来保证转基因作物的监管。转基因检测中应用最广的是 PCR 检测技术, 由近几年转基因作物检测方法的发展趋势来看, 更快速、更准确和更简便已经成了现阶段研究的重点。本试验结合检测技术的发展趋势, 建立并验证了一套简单、可靠对转基因玉米和大豆
29、的盲样进行检测的方法, 最终确定盲样的转基因成分。玉米盲样 W160983 转基因成分同标准品 MON89034 一致, W160985 同 TC1507 一致;大豆盲样 W160984 同 BPS-CV127-9 一致, W160982 同 GTS40-3-2 一致。该检测方案在转基因作物研究生产、进出境检验和转基因产品安全监管, 尤其是对非准许转基因品种的监管具有实际操作参考性, 为相关检测机构提供了一套有效的检测方案。只有不断加强对转基因作物安全管理, 才能使我国转基因生物事业得到健康和安全的发展。参考文献1James C.2016 年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势.中国生物工程
30、杂志, 2017, 37 (4) :1-8. 2James C.2015 年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势.中国生物工程杂志, 2016, 36 (4) :1-11. 3姜天海.全球转基因种植面积再创历史新高.科学新闻, 2017 (5) :75-77. 4沈平, 章秋艳, 林友华, 等.推进我国转基因玉米产业化的思考.中国生物工程杂志, 2016, 36 (4) :24-29. 5李楠.转基因植物基因漂移及生态风险研究的文献计量学分析.江苏农业科学, 2015, 43 (12) :62-67. 6郭建英, 万方浩, 韩召军.转基因植物的生态安全性风险.中国生态农业学报, 2008,
31、16 (2) :515-522. 7付仲文.中国农业转基因生物安全管理.转基因生物与环境国际研讨会, 2004. 8熊建文, 彭端, 韦剑锋.转基因玉米研究与应用进展.广东农业科学, 2012, 39 (6) :27-29. 9GB/T 1861-3-2012.转基因植物及其产品成分检测玉米内标准基因定性 PCR方法.北京:中国标准出版社, 2012. 10GB/T 1485-15-2010.转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米MON88017 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2010. 11GB/T 869-12-2007.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米
32、 GA21 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2007. 12GB/T 1485-16-2010.转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 MIR604 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2010. 13GB/T 2031-5-2013.转基因植物及其产品成分检测耐旱玉米 MON87460 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2013. 14GB/T 1861-4-2012.转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 MON89034 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2012. 15GB/T 2031-6-2013.转基
33、因植物及其产品成分检测抗虫玉米 MIR162 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2013. 16GB/T 2122-16-2014.转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 MON810 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2014. 17GB/T 869-10-2007.转基因植物及其产品成分检测抗虫玉米 MON863 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2007. 18GB/T 2122-15-2014.转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米Bt176 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2014. 19GB
34、/T 2122-9-2014.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米 DAS-40278-9 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2014. 20GB/T 869-7-2007.转基因植物及其产品成分检测抗虫和耐除草剂玉米TC1507 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2007. 21GB/T 2031-13-2013.转基因植物及其产品成分检测转淀粉酶基因玉米 3272及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2013. 22GB/T 1485-9-2010.转基因植物及其产品成分检测抗虫耐除草剂玉米 59122及其衍生品种定性 PCR
35、 方法.北京:中国标准出版社, 2010. 23GB/T 869-13-2007.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂玉米 NK603 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2007. 24GB/T 2031-8-2013.转基因植物及其产品成分检测大豆内标准基因定性 PCR方法.北京:中国标准出版社, 2013. 25GB/T 1861-2-2012.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆 GTS 40-3-2 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2012. 26GB/T 1485-6-2010.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆 MON89788及其
36、衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2010. 27GB/T 2031-8-2013.农业部 2259 号公告-7-2015 转基因植物及其产品成分检测抗虫大豆 MON87701 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2013. 28GB/T 2122-4-2014.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂和品质改良大豆MON87705 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2014. 29GB/T 2259-6-2015.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆 MON87708及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2015. 3
37、0GB/T 2122-5-2014.转基因植物及其产品成分检测品质改良大豆 MON87769及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2014. 31GB/T 1782-5-2012.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆 CV127 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2012. 32GB/T 1782-4-2012.转基因植物及其产品成分检测高油酸大豆 305423 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2012. 33GB/T 1782-1-2012.转基因植物及其产品成分检测耐除草剂大豆 356043 及其衍生品种定性 PCR 方法.北京:中国标准出版社, 2012. 34李荣华, 夏岩石, 刘顺枝, 等.改进的 CTAB 提取植物 DNA 方法.实验室研究与探索, 2009, 28 (9) :14-16. 35GB/T 3576-2013.转基因成分检测大豆 PCR-DHPLC 检测方法.北京:中国标准出版社, 2013.
