1、西安培华学院本科毕业论文（设计） 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用题目 苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用作者姓名 赵 帅 指导教师 吴 元 明二级学院 医 学 院专 业 药 学学 号 9B093139- 14 -苯丙酮尿症致病基因检测方法优化和运用摘 要本研究采用聚合酶链式反应（PCR）扩增和测序方法对一个确诊的苯丙酮尿症（PKU）家系的苯丙氨酸羟化酶（PAH）及6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶（PTPS）的基因序列热点突变位点及分布特征进行研究，优化了苯丙酮尿症致病基因检测方法。结果表明：家系中父亲和母亲是苯丙酮尿症致病基因PAH的突变携带者，儿子同时遗传了父亲和母亲的突变基因，导致其患病，
2、是典型的PKU家系，本研究为苯丙酮尿症患者产前诊断、治疗、遗传咨询、优生优育奠定基础有重要意义。关键词：PKU；PAH；PTPS；突变热点Phenylketonuria pathogenic gene detection method optimization and applicationAbstractThrough the polymerase chain reaction (PCR) amplification and sequencing ，this research discussed hotspot mutation sites and distribution characte
3、ristics of the phenylalanine hydroxylase (PAH) and 6 - pyruvoyl tetrahydro pterin synthase (PTPS) genes in the phenylketonuria (PKU) family. The research optimized the detection methods of phenylketonuria disease genes. The results showed that the mother and father in the family were the carriers of
4、 PAH gene. Because of inheriting the genes of the father and mother at the same time, the son leaded to the PKU. For phenylketonuria prenatal diagnosis, therapy, genetic counseling, prenatal and postnatal care of patients, the study laid the foundation for an important significance.Keywords: PKU; PA
5、H; PTPS; Mutation目 录引 言1 1 实验材料3 1.1 样本来源3 1.2 主要试剂3 1.3 主要仪器32 实验方法4 2.1 DNA 提取4 2.2 PCR 扩增4 2.2.1 PCR 反应体系4 2.2.2 反应条件4 2.3 琼脂糖凝胶电泳5 2.3.1 琼脂糖凝胶的制备5 2.3.2 胶板的制备5 2.3.3 加样5 2.3.4 电泳6 2.3.5 观察6 2.4 测序6 2.5 统计学分析63 实验结果64讨论8结 论9 参考文献10致 谢11附 录12引 言苯丙酮尿症（phenylketonuria，PKU）是一种氨基酸代谢异常的遗传病。因其致病基因在常染色体上
6、，所以发病几率和性别无关1。根据发病机制不同，学者把苯丙酮尿症分为两个类型，一类是典型 PKU，病因是苯丙氨酸羟化酶（phenylalanine hydroxylase，PAH）基因突变导致苯丙氨酸羟化酶缺乏所致，占 全部疾病的98%99%；另一类是四氢生物喋呤缺乏症（tetrahydrobiopterindeficiency，BH4D），病因是苯丙氨酸羟化酶的辅酶，四氢生物喋呤（tetrahydrobiopterin，BH4）缺乏所致，占 1%2%。PKU的主要临床表现为，皮肤色浅、头发细黄、虹膜淡黄色，同时尿有“发霉”臭味或鼠尿味，智力低下；而且60%患儿有脑电图异常和继发性癫痫2，严重者
7、甚至可能导致死亡3。苯丙酮尿症在全世界有广泛的发病几率，但也因地区及种族有明显差异，发病率总体约为 1：5001：100004。有文献报道，苯丙酮尿症发病率白种人大于黑种人和黄色人种。其中Turkey 1：26005、USA约为 1：14000、 the Northern Island约为 1：4400、Germany约为 1：7000、Japan约为 1：784006。根据国家新生儿筛查中心（Newborn screening，NBS）提供数据显示，我国新生儿苯丙酮尿症发病率为 1/11 5727。而陕西省 2004 年2009 年的新生儿的苯丙酮尿症发病率高达 1/3425。也有文献报道我
8、国 PKU 发病存在着北方高于南方，东部地区低于中部和西部地区的特点8。苯丙酮尿症作为可治疗的遗传代谢性疾病之一，若能达到早诊断、早治疗，就能有效地控制该病的发生与发展，最大限度地减少社会和家庭的负担，为提高我省人口素质具有一定意义。PKU 的致病基因的发现可以追溯到 1983 年，苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因被成功分离、克隆9。苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因位于常染色体 12q24.1，大约由 1.5Mb 碱基组成。PAH 基因是割裂基因，编码区包含 13 exons，同时被12 introns所分隔。转录时剪接intron形成仅包含exon的 1353bp 的单链，即包含 451密码子的可译
9、框。信使核糖核酸（mRNA） 翻译成含 451 氨基酸的酶单体，单体聚合成有功能的 PAH 酶10,11。截至2011.5月，国内外已发现 PAH基因的 564 种突变（http:/www.mcgill.ca/pahdb）。PAH 基因的突变大部分位于编码区的基因的突变，在苯丙氨酸羟化酶基因中仅仅影响一个或多个氨基酸，其对酶活性的影响强烈依赖于突变的形式和位置，根据对苯丙氨酸羟化酶酶活性有无影响，突变又可分为致病突变和沉默突变。致病突变大多位于exon上，严重影响苯丙氨酸羟化酶基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响苯丙氨酸羟化酶的催化活性。沉默突变对苯丙氨酸羟化酶活性无
10、影响。苯丙酮尿症中5种重要的酶参与辅酶四氢生物喋呤的合成或代谢循环，可以说其中任何一种酶基因的缺陷均可导致BH4缺乏型PKU(即非经典型苯酮尿症,也称恶性苯酮尿症)。BH4是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等三种芳香族氨基酸羟化酶作用所必需的辅助因子，而6-丙酮酰四氢喋呤合成酶（6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase，PTPS）是合成BH4的关键酶之一，其缺陷是BH4缺乏型PKU的最常见病因。尽管经典PKU总发病率低于西方人，但有调查表明我国汉族人群BH4缺乏型PKU较西方人为多12。追溯到1986年就有通过生化手段进行BH4缺乏型PKU的产前诊断的报道，但因羊水中的
11、生物蝶呤极不稳定,PTPS酶学分析方法较复杂而使其应用受到限制13-15，6-丙酮酰四氢喋呤合成酶(6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase，PTPS)是BH4合成必需的催化酶，PTPS缺乏是导致BH4D的最主要原因。PTPS全长约9 kb，共有6个exon，编码145个氨基酸，已报道的突变主要分布在exon2、5、6。苯丙酮尿症致病基因苯丙氨酸羟化酶 和6-丙酮酰四氢喋呤合成酶基因突变具有以下特点：（1）突变位置多变：所有exon、intron、5-UTR 和 3-UTR 区均发现突变 。（2）突变类型多样：有错义突变（60.08%）、小缺失突变（13.35%
12、）、剪接位点突变（11.03%）、沉默突变（7%）、无义突变（4.98%）、小插入（1%）、大片段插入罕见（A，母亲的突变位点是exon7上的c.728GA，儿子分别遗传了父母的突变基因，为复合杂合突变类型（见表3-1和图3-1），其中p.Arg243Gln为 本 次 研 究 新 发 现 （ 图 3-2B，C）， 在 国 际 PAH 数 据 库（http:/www.mcgill.ca/pahdb）中尚未报到，提交并已被国际 PAH 基因突变数据库收录。另一苯丙酮尿症致病基因PTPS在家系中均未检测到突变。表3-1 苯丙酮尿症致病基因苯丙氨酸羟化酶基因突变检测结果姓 名 核苷酸改变 蛋白质改变
13、突变位置 突变类型父 亲 c.442-1GA - I4 剪接母 亲 c.728GA p.Arg243Gln E7 错义儿 子 c.442-1GA - I4 剪接 c.728GA p.Arg243Gln E7 错义图3-1 PAH intron4（I4）突变检测的测序结果。红色箭头所指为突变位点。A：父亲；B：母亲；C: 儿子。图3-2 PAH exon7突变检测的测序结果。红色箭头所指为突变位点。A：父亲；B：母亲；C: 儿子。4 讨论PAH基因的突变大部分位于编码区的小的遗传学变化，在苯丙氨酸羟化酶基因中仅仅影响一个或多个氨基酸，其对酶活性的影响强烈依赖于突变的形式和位置。根据突变类型对PA
14、H酶活性的影响情况，突变可分为致病突变和沉默突变两种。沉默突变对PAH酶活性无影响。致病突变大多位于exon，严重影响PAH基因转录和翻译及蛋白质的异常折叠、聚合，以及加速降解，从而影响PAH的催化活性19。本研究共发现了2种突变，包括1种错义突变和1种剪接位点突变。其中剪接位点突变和由于直接影响了蛋白的转录或翻译，通常被认为是致病性突变，而错义突变的致病性质是需要经过体外表达、蛋白结构分析等进一步研究证明20。本研究的家系中PTPS基因没有显示突变，由于PTPS缺陷所致PKU发病率低，对一个家系而言突变是相对固定的。但是对于PTPS缺陷症进行产前基因诊断，可以对先证者和父母的突变分析的基础上
15、，选择合适的分子生物学手段，如以PCR人工增加限制酶位点、DNA序列分析和最新发展的DNA芯片等技术，这样就可以对绝大多数PTPS缺陷症进行产前基因诊断。本课题对PKU患者PAH基因和PTPS基因突变位点的探讨，为家系PKU的研究提供重要补充资料，为有效降低PKU发病率，提供可靠科学依据，对减少PKU患儿的发生，提高人口素质具有重要意义，同时也为深入开展PKU的基因诊断、产前诊断以及今后的基因治疗奠定了基础。结 论任何疾病的发生都是遗传物质和环境因素相互作用的结果。人类疾病基因和相关基因的定位、分离和克隆，为现代医学带来了空前的机遇。基因诊断是伴随着遗传学和细胞分子生物学理论和技术迅速发展而产
16、生的一种新型诊断技术。在 PKU 疾病诊断过程当中，基因诊断为进一步的产前诊断，疾病筛查奠定基础，将向着高稳定性、高可靠性、高效率以及快速简便经济的方向发展，相信最终将会造福人类。参考文献1 顾学苑,新生儿筛查现状和展望J,广东医学.2000,7,21(7):21-25.2 顾学范,苯丙酮尿症的诊断和治疗,广东医学,2000,21(7):535-536.3 Antshel KM,Waisbren SE.Timing is everything,executive functions in children exposed to elevated levels of phenylalanine
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26、nstiutions for mentally retarded in IsfahanJ.Mutat Res,2003,526(1-2):45-52.致 谢本研究是在我的导师吴元明副教授的悉心指导下完成的。他渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风，诲人不倦的高尚师德，严以律己、宽以待人的崇高风范，朴实无华、平易近人的人格魅力对我影响深远。不仅使我树立了远大的学术目标、掌握了基本的研究方法，还使我明白了许多待人接物与为人处世的道理。在此，谨向吴老师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢第四军医大学实验室提供了良好的环境，保障论文顺利完成，感谢实验室各位老师给我的帮助！最后，我想对我的母校，
27、我的父母亲人们，我的老师和同学们表达我由衷的谢意。感谢我的家人对我大学四年学习的默默支持；感谢培华学院给了我在大学四年深造的机会，让我能继续学习和提高；感谢老师和同学们四年来的关心和鼓励。附 录英文缩略词对照表英文缩写英文全称中文译名PKUphenylketonuria苯丙酮尿症PAHPhenylalanine hydroxylase苯丙氨酸羟化酶BH4tetrahydrobiopterin四氢生物喋呤BH4Dtetrahydrobiopterin deficiency四氢生物喋呤缺乏症PTPS6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶PCRpolymerase chain reaction聚合酶链反应NBSNewborn screening新生儿筛查中心
