1、http:/更多相关文档免费下载请登录: http:/-中文 word 文档库课题 3：卵泡闭锁的分子调控年度总结报告刘红林（南京农业大学）本文档由【 中文 word 文档库】 提供，转载分发敬请保留本信息；中文 word 文档库 免费提供海量范文、教育、学习、政策、报告和经济类 word 文档。一、 年度计划执行情况1. 年度计划完成情况；一年来，我们围绕卵泡发育和闭锁分子机理与调控的主题开展有关基础理论研究，在 microRNAs 通过抑制靶基因的表达促进猪卵泡颗粒细胞凋亡、FOXO1 参与氧化应激引起的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡、VEGF、FSH 等对卵泡血管发育以及卵泡发育与闭锁的影响、卵母
2、细胞中敲除 GGPPs 基因对小鼠生殖性能的影响、束缚应激对卵母细胞细胞发育能力影响的机理、葡萄糖代谢及药物对卵母细胞老化的调控以及促性腺激素调控卵母细胞减数分裂的信号通路研究以及全基因组关联研究定位多囊卵巢综合征易感基因位点等方面取得一些进展。发表标注 2007CB947403 资助的 SCI 论文 10 篇，有正高 6 人，副高 3 人，中初4 人，博士后 3 人，博士生 11 人，硕士生 9 人参与研究工作。现将完成的主要工作汇报如下：2. 研究工作的主要进展；（1）miR-26b 通过抑制靶基因 ATM的表达促进猪卵泡颗粒细胞凋亡目前已知的猪 miRNA 数量较少，课题组利用生物信息学
3、方法，将猪的EST 序列与人和小鼠的 miRNA 进行比对，再通过进一步的筛选，在猪上成功预测了 98 种新 miRNA。利用 ParafloTM microRNA 微阵列基因表达技术建立了卵泡闭锁过程中 miRNA 表达谱，比较分析了健康卵泡、轻度闭锁卵泡、重度闭锁卵泡的 miRNA 表达差异，筛选到数 24 种在猪卵泡闭锁启动过程中表达活性显著变化的 miRNA,其中表达上升的 11 种，表达下降的 13 种，部分是课题组新预测的 miRNA。对于筛选得到的 24 种差异表达的 miRNA，进一步预测其靶基因，并对靶基因进行 GO 及 Pathway 分析，从而发现其中 6 种 miRNA
4、 的http:/更多相关文档免费下载请登录: http:/-中文 word 文档库主要生物学作用集中在细胞增殖、细胞分裂、细胞凋亡、DNA 复制、细胞粘附、蛋白质向核内的运输等方面，这 6 种 miRNA 分布于 let-7 家族（let-7a、let-7b、let-7c、let-7g、let-7i、 ）和 miR-26b，从中我们重点选择了 miR-26b 进行下一步研究。卵泡闭锁起因于颗粒细胞的凋亡，所以课题组着重研究了 miR-26b 调控颗粒细胞凋亡的机制。体外培养猪卵巢颗粒细胞，转染 miR-26b mimic，通过流式细胞仪检测发现 miR-26b 确实能在体外诱导颗粒细胞凋亡；在
5、预测的 miR-26b靶基因中，我们发现了 DNA 损伤的上游效应蛋白 ATM，ATM 主要调控 DNA损伤修复和细胞周期。Real-time PCR 检测发现，颗粒细在转染 miR-26b 后ATM 表达量下降。为了进一步探索 miR-26b 与 ATM 之间的关系，我们将ATM 序列中 miR-26b 的结合位点连接到荧光素酶基因的 3-UTR 区，通过荧光素酶活性检测证实了 ATM 是 miR-26b 直接靶基因；为了检测转染 miR-26b 后颗粒细胞 DNA 损伤情况，我们采用 TUNEL 染色结合流式细胞仪证实转染miR-26b 后颗粒细胞 DNA 损伤显著增加。综合以上结果，我们
6、推测卵泡闭锁过程中 miR-26b 表达上升，从而抑制ATM 基因的表达，继而影响 DNA 损伤修复，导致颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁。（2）FOXO1 参与氧化应激引起的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡采用双氧水处理体外培养的小鼠卵泡颗粒细胞，建立体外氧化应激模型。试验发现氧化应激导致的颗粒细胞凋亡具有双氧水浓度依赖性，TUNEL 染色发现颗粒细胞凋亡随双氧水浓度的升高显著增加，Real-time RCR 检测表明凋亡标志基因 Caspase 3 的表达量在氧化应激后显著增加；为了研究 Foxo1 是否参与氧化应激过程，我们检测了 Foxo1 及其下游调控基因（ Bim、TRAIL、FasL）的表达，结果发现
7、氧化应激后 Foxo1 其下游调控基因 Bim、TRAIL、FasL 的mRNA 表达量均显著增加,Western 结果显示氧化应激后 Foxo1 的蛋白水平也显著增加；为了进一步验证 Foxo1 参与氧化应激过程，我们筛选了高效抑制Foxo1 基因的 siRNA，在 Foxo1 干涉后，氧化应激诱导的颗粒细胞凋亡显著下降，且 Bim、 TRAIL、FasL、Caspase 3 基因表达量也显著下降；免疫荧光染色发现，氧化应激导致 Foxo1 蛋白入核增加，干涉后，核内的 Foxo1 减少。该研究表明，氧化应激在转录和翻译水平促进了 Foxo1 基因的表达，并增加该蛋白入核，从而激活下游凋亡相
8、关基因的表达，进而诱导颗粒细胞凋亡。（3）VEGF、FSH 等对卵泡血管发育以及卵泡发育与闭锁的影响采用活体腹腔注射法探讨血管发育影响因子血管内皮生长因子（VEGF） 、http:/更多相关文档免费下载请登录: http:/-中文 word 文档库雌激素 E2（17-estradiol） 、促卵泡激素（FSH ） 、2-甲氧基雌二醇（2-ME 2） 、4-羟基雌二醇（4-OHE 2） 、 FSHR antagonist（FSH 受体拮抗剂）对卵泡血管生成及卵泡发育的影响，探测卵巢 VEGF 表达与 FSH、E 2 及其代谢产物之间的协作调控关系。两周龄和六周龄小鼠分别分成 control、VE
9、GF、E2、FSH、2-ME2、4-OHE2 、FSH+2-ME2、VEGF+FSHR 八组，腹腔注射各种药物（为了克服情期的影响，性成熟小鼠阴道涂片判明情期，发情后期开始注射） ，卵巢连续切片，然后经 HE 染色统计各级卵泡数量及其卵泡周围红细胞数目，并定量检测颗粒细胞中 Flk-1,VEGF 表达水平。结果表明：1)性成熟前卵巢发育对 VEGF依赖性更强，FSH 和 VEGF 存在协作;2) 性成熟前大卵泡的发育对 FSH 的依赖性更强，FSH 和 VEGF 在大卵泡发育中存在协同作用,2-ME 2 等的抑制作用随着小鼠性成熟而逐渐减弱至消失;3)小鼠性成熟前后， FSH 拮抗剂均能削弱
10、VEGF的作用；4）随着小鼠性成熟，FSH 和 VEGF 抑制小卵泡的发育，且两者的抑制作用具有协同效应；5）2-ME 2、4-OHE 2 促进卵泡闭锁，而 FSH 则抑制卵泡闭锁，且 2-ME2 的闭锁作用可以在 FSH 作用下发生逆转；阻断 FSH 的作用在小鼠性成熟过程中均能使 VEGF 的作用减弱而导致更多的卵泡闭锁发生；6）E2 的代谢物能抑制血管发育，而且在小鼠性成熟前 FSH 能拮抗这种抑制作用，FSH 和 VEGF 能协同作用促进血管发育；7）阻断 FSH 的作用在小鼠性成熟前能使 VEGF 促进血管生成的作用减弱，增加 FSH 也能使 2-ME2 的抑制作用减弱，而在小鼠性成
11、熟后增加 FSH 对 2-ME2 的拮抗作用有限；8）外源 VEGF、FSH促进颗粒细胞目标基因表达，而且 VEGF 对目标基因表达的促进作用依赖于FSH，FSH 的促进作用能够为 2-ME2 所抑制，4-OHE 2 抑制颗粒细胞中 VEGF 基因的表达。（4）卵母细胞中敲除 GGPPs基因对小鼠生殖性能的影响采用 Cre/Loxp 系统成功获得了特异在卵母细胞内敲除 GGPPs 基因的小鼠。GGPPs 基因敲除显著降低了小鼠的生育能力（妊娠率、产仔率） 。为了研究GGPPs 基因敲除影响小鼠生育能力的机制，我们分析了敲除鼠卵泡发育、卵子发育能力。GGPPs 基因敲除不仅降低了自然状态下的卵巢
12、重量，而且显著降低了 PMSG 注射 48h 和超数排卵后小鼠卵巢的重量，说明敲除鼠对激素敏感性显著降低；通过卵巢切片，卵泡计数发现，GGPPs 基因敲除减少了自然状态下小卵泡（50-150m）和中卵泡（150-250m ）数量， PMSG 注射 48h 后卵泡计数发现敲除鼠不仅中、小卵泡数量低于对照组，而且大卵泡的数量（250m）也显著低于对照组，进一步证实敲除鼠对激素敏感性降低；对卵泡的电镜观察发http:/更多相关文档免费下载请登录: http:/-中文 word 文档库现，GGPPs 基因敲除影响了颗粒细胞与卵母细胞之间的连接，颗粒细胞不再伸出向卵母方向的细胞突出；Real-time
13、RCR 检测表明，GGPPs 基因敲除对颗粒细胞凋亡相关基因（Fas L、Bim 、Caspase 3）的表达没有显著影响；卵子方面的研究发现，GGPPs 基因敲除不仅使超排后获得的卵母细胞数显著降低，而且降低了卵母细胞质量，即异常卵母细胞的比率显著增加，2-cell 发育至囊胚的比率显著下降。 此部分试验证实，GGPPs 基因敲除可能通过阻断颗粒细胞与卵母细胞之间的连接，降低卵泡对激素的敏感性，从而影响卵泡发育，进而降低卵母细胞数量和质量，使小鼠生育能力下降。（5）小鼠心理（束缚）应激模型的完善我们建立的束缚应激系统既能限制小鼠活动，又允许小鼠自由采食和饮水。最近对束缚应激小鼠的采食和饮水量
14、进行了观察。结果发现，用我们的系统束缚小鼠 24 小时期间，采食量和饮水量都与对照组无明显差异。另外，由于我们用于束缚的小鼠笼就放在原有大笼子内，温度和光照等环境均未发生改变，基本克服了其他系统的弊端。（6）母体束缚应激对小鼠卵母细胞细胞染色体倍性影响的研究研究表明，人类大约有 20%卵母细胞染色体出现非整倍体，而且随年龄的增长非整倍体比例更高。大多数的非整倍体卵母细胞形成的胚胎都不能存活，很少的存活下来便出现 21 三体（Trisomy 21，Down syndrome） 。我们原来的研究（BOR, in press）证明，母体束缚应激削弱卵母细胞的发育能力，但具体作用机理不清楚。既然衰老能
15、够导致卵母细胞染色体畸变，那么，心理应激是不是也会像母体衰老一样造成卵母细胞的非整倍性或者其它基因损伤？我们研究了母体束缚应激对小鼠卵母细胞细胞染色体倍性的影响。结果表明：（1）应激使胚胎发育速度放慢，囊胚率降低；（2）应激 MII 卵母细胞染色体非整倍体数目显著增多，但提前分裂不明显；（3）应激 2-4 细胞胚胎非整倍体增多，但混倍体不增加；（4）应激加快成熟进程，造成纺锤体组装异常；（5）应激卵MAD2 在 GV 期显著高于对照，pMI 低于对照，变化剧烈；（6）应激使还原型GSH 减少，卵还原能力下降。总之，应激引起氧化应激，使纺锤体微管组装和MAD2 表达异常，导致卵染色体倍性异常。（
16、7）束缚应激对小鼠卵巢和卵母细胞凋亡影响的研究我们原来的研究证明，体内皮质醇升高能够不依赖下丘脑-垂体-性腺轴地降低卵母细胞发育能力，而体外添加生理浓度皮质醇并不影响卵母细胞发育能http:/更多相关文档免费下载请登录: http:/-中文 word 文档库力。因此，皮质醇有可能是通过作用于卵巢上 COC 以外的其它组织而削弱卵发育能力的。于是，我们进行了以下研究。小鼠注射 eCG 后 24 h 开始应激 24 h。应激后立即处死小鼠获取卵巢和血液进行实验。本研究证明，应激通过上调糖皮质激素（G） 、CRH 和 CRHR1 削弱卵发育能力。其机理如下：1）应激影响E2 产生：CRH 通过 CR
17、HR1 抑制 theca 睾酮而抑制雌二醇； CRH 下调 MGC 的IGF-1 而抑制雌二醇；G 抑制雌二醇。2）应激引发凋亡：E2 减少引发凋亡；MGC 的 IGF-1 下调或 IGF-1 分泌减少引发凋亡；卵母细胞产生 CRH，卵丘细胞 CRHR1 上调引起培养过程中凋亡。 3）应激影响卵发育能力：卵泡液雌二醇减少发育能力下降；IGF-1 量减少造成的发育能力下降；卵丘凋亡降低卵发育能力。（8）葡萄糖代谢对卵母细胞老化调控研究结果证明（1）卵丘细胞葡萄糖代谢通过提供能量和降低氧化应激两种途径抑制卵母细胞老化；（2）卵丘细胞的糖酵解途径依赖 PPP 途径提供中间产物如 6-磷酸果糖。（9）
18、咖啡因抑制卵母细胞老化效率及可恢复性研究证明咖啡因能够通过维持 MPF 活性来可逆性地阻止卵母细胞老化，但不同类型卵母细胞要求不同最佳处理方案。（10）性成熟和促性腺激素对卵母细胞减数分裂调控作用信号通路的研究发现性成熟前小鼠卵母细胞 MPF 活性高，但减数分裂进程反而慢。进一步研究证明，造成 MPF 活性升高的关键是腺苷酸环化酶活性低而 CDK1 活性高；减数分裂进程慢主要是由于 CDK1 未能及时迁移到 GV 中。3. 如有重要阶段性成果或突破，请重点阐述（每项 300-500 字） ，另附图片。1）急性束缚应激对小鼠卵母细胞发育能力影响的研究应用自己建立的束缚应激系统对母鼠进行急性应激结
19、果显示：（1）在卵母细胞生长和成熟阶段对母鼠进行束缚应激升高血清皮质醇水平，降低卵母细胞发育能力。 （2）注射适当浓度皮质醇也降低卵母细胞发育能力。 （3）自然发情小鼠束缚应激后卵母细胞发育能力的下降伴随血清皮质醇浓度升高和 FSH 水平下降，但注射皮质醇并不改变自然发情小鼠 FSH 水平。 （4）超排小鼠尽管注射了过量的 FSH，但束缚应激依然降低卵母细胞发育能力。 （5）添加生理浓度http:/更多相关文档免费下载请登录: http:/-中文 word 文档库Cortisol 不影响卵母细胞体外成熟。 （6）初步证明添加皮质醇诱发卵泡细胞产生胰岛素抵抗。这些都表明，皮质醇（甚至母体应激本身
20、）对卵母细胞发育能力的损伤可能不依赖于 HPG 轴，而很可能是升高的皮质醇水平影响卵泡细胞对葡萄糖的利用，从而影响卵母细胞发育成熟。论文全文发表在 Biology of Reproduction 上。2）全基因组关联研究定位多囊卵巢综合征易感基因位点多囊卵巢综合症（PCOS）是一种常见的妇女代谢紊乱症。为了识别致病基因，我们以汉族女性为研究对象进行了 PCOS 的全基因组关联研究（GWAS） 。研究对象包括 744 例 PCOS 患者和 895 名正常对照，随后的重复验证研究涉及两个独立的族群（PCOS 患者 2,840 例和对照 5012 例来自中北部地区; PCOS 患者 498 例和对照
21、 780 例来自中国南部及中部地区） 。我们提出了强有力的证据表明 PCOS 和三个位点之间的关联：2p16.3，2p21 和 9q33.3。这些发现为人们对PCOS 的发病机制的相关研究提供了新见解，也为人们在这些染色体区域选择候选基因进行相关研究提供了线索。论文全文发表在 Nature Genetics 上。二、 课题执行过程中存在的问题及其对策。三、 下年度研究工作计划和进度安排。1、我们将在 microRNAs 促进猪卵泡颗粒细胞凋亡并影响卵泡发育及闭锁、FOXO1 参与氧化应激引起的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡以及卵母细胞中敲除GGPPs 基因对小鼠生殖性能的影响三个方面进行进一步的综合实验
22、，尤其是选择更多家族的相关 microRNAs 进行分析，并从类固醇激素代谢途径和蛋白异戊二烯化途径研究基因敲除小鼠卵泡发育缺陷和繁殖障碍机理。2、我们以前的研究证明，母鼠长期应激导致后代焦虑水平降低和雄性后代认知能力提高。继续进行这些行为的可遗传性及分子机理研究。3、建立捕食者应激的心理应激模型，研究心理应激对卵母细胞成熟和发育能力的影响。4、注射糖皮质激素不依赖 HPG 轴和 HPA 轴而影响卵母细胞发育能力的机理研究。5、小 RNA 在介导卵母细胞、生长因子及细胞因子抗卵丘细胞凋亡中的作用研http:/更多相关文档免费下载请登录: http:/-中文 word 文档库究。本文档由【 中文 word 文档库】 提供，转载分发敬请保留本信息；中文 word 文档库 免费提供海量范文、教育、学习、政策、报告和经济类 word 文档。
