1、 硕士学位论文论文题目 基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究研究生姓名 刘越李锦指导教师姓名专业名称研究方向论文提交日期药理学神经精神药理2014年 4月基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究 中文摘要中文摘要目的：基于血管紧张素型（ AT1）受体和过氧化物酶增殖激活物受体 （PPAR）在抗氧化应激和神经保护中的重要作用，我们选择性修饰替米沙坦分子中联苯羧酸结构单元，获得新结构的候选化合物 Tek-1。本论文采用分子药理学实验技术证明 Tek-1同时为 AT1受体阻断剂和 PPAR激动剂，具有双重靶点的受体药理学特性；体内评价 Tek-1 对-
2、淀粉样蛋白（-amyloid, A）诱导的小鼠学习记忆能力的影响，并对 Tek-1 参与神经炎症反应的小胶 质细胞功能的调节作用及其分子信号转导机制进行研究，以期发现更优的 PPAR激动活性的 AT1受体拮抗剂。方法：首先采用放射性受体配体结合实验、细胞内钙离子流动检测实验及报告基因检测系统评价 Tek-1 对 AT1受体的亲和力、拮抗活性及对 PPAR 的激动活性；其次在 C57BL/6J 小鼠 侧脑室注射寡聚态 A1-42建立的模拟阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）病理改变的小鼠模型上， 连续给予替米沙坦（1、3mg/kg）和 Tek-1（1、3、10mg/kg）4
3、周，采用 Morris 水迷宫及新物体识别实验观察替米沙坦和 Tek-1对 AD样模型小鼠空 间及非空间学习记忆能力的影响，并采用 ELISA的方法检测脑内白介素-6（IL-6 ）和单核细胞趋化因子（MCP-1）的含量；最后，建立细菌脂多糖（LPS） 诱导的 BV-2小鼠小胶质细胞炎症模型，采用 0.1-10M的替米沙坦、Tek-1与小胶质细 胞单独孵育，或替米沙坦、 Tek-1与 PPAR特异性拮抗剂 GW9662 共同孵育，用 ELISA的方法检测替米沙坦和 Tek-1对小胶质细胞释放的肿瘤坏死因子-（TNF-）的影响，用实时定量 PCR的方法检测替米沙坦和Tek-1对小胶质细胞标记物 C
4、D11b、巨噬细胞标记 物 CD16和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的mRNA 水平表达的影响；通 过Western Blot的方法检测替米沙坦和Tek-1对 LPS诱导的小胶质细胞内 丝裂原活化蛋白激酶（ MAPKs）信号通路和核转录因子-B（NF-B ）信号转导 通路的影响。结果：放射配体结合实验结果表明 Tek-1 对 AT1 受体均具有较高的亲和力，其竞争抑制常数 Ki值分别为 1.110 M；在细胞内钙离子检测实验中，Tek-1抑制-9AT1受体激 动剂 ANG激动效应的 IC50值分别为 1.02nM，提示 Tek-1是 AT1受体的阻断剂；在 PPAR报告基因检测实验中，在 0.
5、1-10M 浓度范围内，Tek-1能浓I中文摘要 基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究度依赖的显著激活 PPAR，但激动效应显著低于 PPAR完全激动剂罗格列酮，提示 Tek-1为 PPAR的部分激动剂。分别灌胃给予替米沙坦（1、3mg/kg）和 Tek-1（1、3、10mg/kg）均能显著改善 AD样模型小鼠非空间记忆能力。ELISA结果显示，1mg/kg替米沙坦和 1、3、10mg/kg Tek-1能显著减少脑内促炎因子 IL-6 的表达（P值均为 P0.001），1mg/kg替米沙坦和 1、3mg/kg Tek-1能显著减少脑内趋化因子 MCP-1的表达。在LP
6、S诱导的 BV-2小鼠小胶质细胞炎症模型中，0.1-10M替米沙坦和 10MTek-1能显著抑制小胶质细 胞释放 TNF-（P0.001和 P0.05）；实时定量 PCR结果表明，10M替米沙坦和 1、10M Tek-1均能显著抑制 CD11b、CD16和 iNOS基因水平表达，PPAR特异性拮抗剂 GW9662 能够部分逆转替米沙坦和 Tek-1 的上述作用，提示其改善炎症反应的作用与部分激活 PPAR，进而抑制小胶质细胞的激活和炎性介质的释放相关；Western Blot结果显示， 0.1-10M 替米沙坦和 0.1、1M Tek-1能抑制 LPS诱导的 BV-2小胶质细胞激活后引起的 E
7、RK、JNK和 p38MAPK磷酸化水平升高以及 IB-蛋白的降解和细 胞核 NF-B蛋白的升高，PPAR拮抗剂 GW9662 能部分拮抗替米沙坦和 Tek-1 的上述作用。结论：1、Tek-1对 AT1受体具有较高的亲和力，并且能显著抑制 ANG对细胞内钙离子的激活作用，为 AT1受体的拮抗剂；2、与 PPAR完全激动剂罗格列酮相比，Tek-1具有部分激活 PPAR的特性；3、以替米沙坦为阳性化合物，Tek-1长时程给药同样能改善 A诱导的小鼠学习记忆损伤，并且 Tek-1能够抑制脑内促炎细胞因子和趋化因子的释放，提示其改善学习记忆的效应与减轻脑内炎症反应密切相关；4、在体外 LPS诱导的
8、BV-2小鼠小胶质细胞的致炎模型上， Tek-1能够抑制 BV-2小胶质细胞的激活和激活后释放炎性介 质，其作用机制可能与部分激活PPAR，进而抑制 MAPKs及 NF-B 信号通路的激活相关。关键词：候选化合物 Tek-1 ；替米沙坦；血管紧张 素型受体拮抗剂；过氧化物酶增殖激活物受体；小胶 质细胞；神经炎症；阿 尔茨海默病作 者：刘越指导老师：李锦II基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究 英文摘要The pharmacological research of Tek-1 relevance toanti-neuroinflammation, a candidate
9、 compound basedon TelmisartanAbstractObjective: Upon the important role of AT1 receptor and PPAR receptor inmodulating anti-oxidative damage and neuroprotection, we designed and acquired thecandidate compound Tek-1 through the modification of biphenyl carboxylic acid unit.In this project, we identif
10、ied the dual pharmacology characteristics based on AT1receptor and PPAR receptor; furtherly, in vivo we evaluated the ameliorative effect ofTek-1 on learning and memory dysfunction in AD mouse model induced bybeta-amyloid (A); we investigated the role of Tek-1 on regulating activated microgliaclosel
11、y related to the neuro-inflammation and signal transduction mechanism in order toobtain new structure AT1 antagonist with better PPAR receptor agonistic bioactivity.Methods: First, through radioligand binding assay on rat vascular smooth musclecells, calcium mobilization HTS assay and PPAR responsiv
12、e-element-luciferasereporter assay, we evaluated the AT1 receptor affinity of Tek-1, and antagonistic activityas well as PPAR agonistic activity respectively; Second, in Alzheimers disease mousemodel of C57BL/6J mice induced by introcerebroventricular injection of A1-42,Telmisartan (1, 3 mg/kg) and
13、Tek-1(1, 3, 10 mg/kg) were continuously administered for4 weeks. Then through the Morris water maze and the novel objects recognition test, weinvestigated the effect of Telmisartan and Tek-1 on the spatial and nonspatial learningand memory abilities in AD mouse model. And the concentration of Interl
14、eukin (IL-6)and monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) in brain were explored using ELISA;Third, we established BV-2 microglia inflammatory model stimulated by bacteriallipopolysaccharide (LPS) in vitro, and then cells were treated with Telmisartan(0.1-10M) and Tek-1 (0.1-10M), or in the presence of
15、 Telmisartan and Tek-1combined with specific PPAR antagonist GW9662. Effects of Telmisartan and Tek-1on the release of tumor necrosis factor-alpha (TNF-) in microglia were analyzed byELISA; the mRNA expression level of microglia marker CD11b, macrophages markerIII英文摘要 基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究
16、CD16 and induced nitric oxide synthase (iNOS) were determined by real-timequantitative PCR; the mitogen-activated protein kinase (MAPKs) and nuclear factor-B(NF-B) signal transduction pathway in BV-2 microglia stimulated by LPS weredetermined by Western Blot.Results: Through the radioassay of recept
17、ors, Tek-1 had high affinity to AT1receptor, the Ki values for AT1 receptor were 1.110 M. In the calcium mobilization-9HTS assay, the effect of AT1 agonist angiotensin II (ANGII) were inhibited by Tek-1 ina concention-dependent manner with IC50 values of 1.02nM. Tek-1 could significantlyactivate PPA
18、R in a concention-dependent manner ranging from 0.1 to 10M.Compared with rosiglitazone, a full agonist of PPAR, Tek-1 behaved as partial PPARagonists.Telmisartan (1, 3mg/kg) and Tek-1(1, 3, 10mg/kg) could significantly improve thenonspatial learning and memory abilities of AD mice induced by A. Telm
19、isartan (1,3mg/kg) and Tek-1(3, 10mg/kg) could significantly improve the spatial learning andmemory ability on AD mice model induced by A. ELISA results showed Telmisartan(1mg/kg) and Tek-1(1, 3, 10mg/kg) could significantly reduce the content of cytokineIL-6(P0.001); Telmisartan (1mg/kg) and Tek-1(
20、1, 3mg/kg) could significantly reducethe content of chemokine MCP-1.In the inflammatory model of BV-2 microglia cell induced by LPS, 0.1-10MTelmisartan and 10M Tek-1 could significantly inhibit the release of TNF-(P0.001and P0.05). Real time quantitative PCR results showed that 10M Telmisartan and 1
21、,10M Tek-1 could significantly inhibit the mRNA expression level of CD11b, CD16and iNOS. Specific PPAR antagonist GW9662 could partially reverse inhibiting theactivation of microglia and releasing of inflammatory mediator. Western blot resultsshowed that 0.1-10M telmisartan and 0.1, 1M Tek-1 decreas
22、ed the phosphorylation ofERK1/2, JNK and p38 or IB- degradation, up-regulated of NF-B in BV-2 microgliacells induced by LPS. Specific PPAR antagonist GW9662 could partially reverse theactivation effect of telmisartan and Tek-1 on BV-2 microglia cells.Conclusion: 1. Tek-1 had high affinity to AT1 rec
23、eptor and could significantlyinhibit the activation of intracellular calcium by ANGII, indicated that it was a anantagonist of AT1 receptor; 2. Compared with full agonist Rosiglitazone, Tek-1 couldpartially activate PPAR; 3. Compared with telmisartan, chronic treatment with Tek1could improve the abi
24、lity of learning and memory ability on AD mice. And Tek-1 couldIV基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究 英文摘要reduce the content of cytokine and chemokine in brain induced by A. This implied theanti-inflammation effects of Tek-1 related to ameliorative effect on learning andmemory dysfunction. 4. Establishme
25、nt of BV-2 microglia inflammatory model inducedby LPS in vitro, Tek1 could inhibit the release of inflammatory mediator, themechanism of which mainly attributed to inhibiting the activation of mitogen-activatedprotein kinase (MAPKs) and NF-B signal transduction pathway.Key words: candidate compound
26、Tek-1; Telmisartan; Angiotensin typereceptor antagonist; peroxisome proliferator-activated receptor-; microglia;neuro-inflammation ; Alzheimers diseaseWritten by：Yue LiuSupervised by：Jin LiV目录前言1第一部分 Tek-1对 AT1受体阻断作用和 PPAR激活效应的评价41研究背景42实验材料43实验方法54统计方法95实验结果96讨论 14第二部分 Tek-1对脑室注射 A1-42致小鼠学习记忆能力下降的影
27、响171研究背景 172实验材料 173实验方法 184统计方法 205实验结果 206讨论 23第三部分 Tek-1抑制 LPS诱导的小胶质细胞炎症及其抗炎机制 251研究背景 252实验材料 263实验方法 264统计方法 295实验结果 306讨论 34结论 37参考文献 38综述 43缩略词表 50致谢 51基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究 前 言前言肾素-血管 紧张素系统（RAS）是体内重要的水电解质平衡调节系统。近年有研究证实脑内也存在独立的 RAS，并发现几乎所有 RAS的成员对神经可塑性、学习记忆等认知功能都起着十分重要的作用 1-2。血管紧张素（
28、 ANG）是 RAS中最主要的活性成分，也被认为是一种促炎因子，它特异性的与血管紧张素型（AT1 ）受体和血管紧张素型（AT2）受体结合，通过 NF-B、NADPH氧化酶等细胞内信号转导途径调节细胞因子、粘液分子等的分泌释放。 AT1受体广泛分布于大脑中，ANG大部分通过激活 AT1受体而刺激 脑血管的收缩、平滑肌细胞增殖、纤维变性等，从而导致微血管渗透性增加和炎症反应，加速脑卒中及其他神经变性疾病的发生与发展。近来许多研究表明，肾素、血管紧张素原、血3管紧张素及其受体在大脑形成初期就已经存在，阻断大脑 AT1受体能改善大脑血管微循环，并减少细胞凋亡、炎症反应及氧化应激。4 5目前，ANG型受
29、体阻断剂（ARBs）已成为一 类重要的治疗心血管疾病如高血压和代谢紊乱的安全、有效药物。在循环系统中 ARBs主要作用是抑制过度激活的 AT1 受体，以舒缓血管张力、降低血压，同时对血管与末端器官也具有抗氧化应激及抗炎的作用。这种重要作用同样也延伸到脑内，并在改善脑内炎症反应方面具有积极的治疗作用。此外，越来越多实验研究表明，ARBs对卒中与糖尿病患者具有神经保护作用，可以减少患者认知功能的下降，改善情绪，而且能够6延缓阿尔茨海默病进程。ARBs的神经保护作用可能涉及多方面机制，包括抗炎、7改善脑循环、调节下丘脑-垂体-肾上腺轴（HAP）应对应激反应，以及保持血脑屏障完整性等。基于其用药安全性
30、、改善炎症、缓解适应负荷及神经保护等作用，ARBs作为治疗情绪紊乱、阿尔茨海默病等神经退行性疾病联合用药的治疗策略已经受到了广泛的关注。阿尔茨海默病是最常见的神经退行性疾病，基因突变、氧化应激、神经性血管病变、炎症免疫反应失衡等都可能导致神经退行性疾病的发生。临床研究发现，在 AD患者的血清和脑脊液中 TNF-和白介素-1（IL-1）的表达均升高8，病理改变也表明脑内固有免疫细胞如小胶质细胞、星型胶质细胞发生过度激活与-淀粉1前 言 基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究样蛋白（A）的沉 积有关 9。因此，目前认为 A 诱导的神经源性炎症是决定神经退行性疾病发生与发展进
31、程的的关键因素之一，抑制脑内炎症反应已经成为治疗神经退行性疾病的重要策略。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR ）是一类配体激活的细胞转录因子，属于型核受体超家族成员，它一般通过调节许多信号通路网络分子的激活与表达而介导脂质及糖类代谢、细胞分化、免疫反应等。PPAR在中枢神经系统中广泛分布，近来流行病学、临床及临床前研究表明，PPAR激动剂能参与调节神经保护，减少多种神经性疾病的发生 。Combs 等的体外 实验也证明，非甾体类抗炎10-11 12药物、噻唑烷二酮类（TZDs）和 15-d-PGJ2等 PPAR激动剂能够抑制 A诱导的小胶质细胞和单核细胞分泌促炎因子如 IL-6、TNF-及环氧
32、合酶-2（COX-2）的表达。这提示我们 PPAR的激活在改善神经炎症中也起着十分重要的作用。替米沙坦是 ARBs中十分具有代表性的一种药物。目前研究表明，替米沙坦不仅具有拮抗 AT1受体的作用，同时也能部分激活 PPAR，其双靶点的活性决定了其不仅具有良好的降压作用，而且也具有其他靶器官保护的特性。已有文献报道，替米沙坦能减少脑缺血面积和水肿的形成，发挥神经保护作用，增强脑功能的恢复 13。而替米沙坦发挥神经保护作用与其激活 PPAR进而抑制或改善凋亡、氧化应激以及神经炎症密切相关。因此，联合针对脑等靶器官的保护作用的降压效应将会进一步扩大替米沙坦的临床应用范围 14。目前认为，对于长期高血
33、压带来其他并发症如肾病变、中风、左心室肥厚等的患者来说，替米沙坦是一个很好的选择。基于目前已有的 ARBs类药物的化学结构和结构效应关系的分析发现，改变ARBs类药物的理化性质能够明显影响 PPAR的激动活性。我们可以通过增加药物的脂溶性，增强膜渗透率促进其结合细胞内 PPAR，从而进一步增强药物激活PPAR的活性。因此，基于替米沙坦具有拮抗 AT1受体与 PPAR 激动双重活性及多样性药理作用特点，特别是抗神经炎症与脑保护作用，以及良好的临床用药安全性，我们集中分析其产生多样性生物活性的构效关系，选择性修饰替米沙坦分子中联苯羧酸结构单元，以 ARBs类药物中联苯四氮唑药效团中四氮唑的生物电子
34、等排体杂环（见图 1）替代修饰替米沙坦分子中羧酸药效团，获得新结构的先导化合物 Tek-1。我们已有的研究 证明，Tek-1 脂溶性 强于替米沙坦，因此我们系统2基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究 前 言评价了 Tek-1是否具有拮抗 AT1受体和激活 PPAR的双重作用靶点的特点，并进一步研究其药理学作用特点，为先导化合物 Tek-1继续进行结构优化提供了详实的体内、体外药理学实验依据。本课题研究的主要内容包括以下三方面：1、评价 Tek-1是否具有 AT1受体拮抗和 PPAR激活的双重特性；2、采用小鼠侧脑室注射 A1-42诱导的 AD样模型，体内评价 Tek-
35、1是否具有改善小鼠空间记忆和非空间记忆的能力，并对 Tek-1对 A诱导的神经炎症的作用进行研究，进一步探讨其对炎症反应的调节作用与学习记忆的关系。3、通过建立 LPS诱导的 BV-2小鼠小胶质细胞炎症模型，在体外评价 Tek-1是否具有抑制 BV-2小鼠小胶质细胞过度激活诱发 的炎症反应，并初步探讨 Tek-1发挥抗炎作用的分子和信号转导机制。N N N NN N N NHOOC Het新化合物替米沙坦N N N NSNN HNOO OHet:N NH NH NH NH NHO O S四唑杂环 四唑环生物电子等排体图 1新化合物设计思路3第一部分 基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Te
36、k-1的药理学研究第一部分 Tek-1对 AT1受体阻断作用和 PPAR激活效应的评价1研究背景替米沙坦属于血管紧张素 I型（AT1）受体阻断剂，是血管紧张素受体拮抗剂中亲和力最高，半衰期最长，血浆分布容积最广的一种抗高血压药物 15。近来研究表明，替米沙坦还具有部分激活 PPAR的作用，并且是目前已知 ARBs中唯一在治疗剂量能激活 PPAR，且激动活性最强的一种。Thoene-Reineke 等在正1716常血压大鼠诱导的脑缺血模型上发现，替米沙坦较血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI ）雷米普利具有更好的神经保护作用，并能减少脑梗塞面积、降低 TNF-等促炎因子的表达。Pablo Garri
37、do-Gil等 18在四氢吡啶（MPTP）引起的帕金森氏症（PD）模型中也发现，替米沙坦具有的神经保护作用与 AT1受体的拮抗及 PPAR的激活有关。由此可见，替米沙坦是 ARBs中具有广阔应用前景的药物，其多样性药理作用，特别是其抗脑部炎症与神经保护作用越来越受到人们的关注。通过选择性修饰替米沙坦分子中联苯羧酸结构单元，并以 ARBs类药物中联苯四氮唑药效团中四氮唑的生物电子等排体杂环替代修饰替米沙坦分子中羧酸药效团，我们获得新结构候选化合物 Tek-1 ，发现该 化合物具有较高的脂溶性，因此认为其透过血脑屏障和细胞膜透过率能力明显增强。因此，我们首先在细胞受体水平评价 Tek-1对 AT1
38、受体的亲和力，并通过报告基因检测系统评价 Tek-1 对PPAR是否具有激动活性和激动效应的强度。2实验材料2.1细胞及质粒大鼠原代血管平滑肌细胞，由军事医学科学院放射与辐射医学研究所惠赠；U2OS细胞系，购于北京协和细胞库；HEK-G15/AT1稳定细胞株，由中科院北京基因组研究所惠赠； pcDNA3.1-eGFP标签质粒，由本实验室保存；表达质粒pSG5-PPAR、报告质粒 pGL3-PPRE及内参质粒 pRL-CMV，由军事医学科学院放4基于替米沙坦抗神经源性炎症的候选化合物 Tek-1的药理学研究射与辐射研究所惠赠。第一部分2.2主要试剂DMEM培养基、Mccoys 5A培养基、胎牛血
39、清、胰蛋白酶，美国 Gibco 公司；probenecid、reddye、DMSO、Fluo-4/AM 、罗格列酮、替米沙坦，美国 Sigma公司； H-ANG(40Ci/mmol)，美国 ARC公司；脂质体 Lipofectamine2000 ，美国3Invitrogen公司；双萤光素酶报告基因分析试剂 Dual-Glo Lucifarase Assay System，美国 Promega公司； Whatman-GF/C滤纸，美国 Whatman公司；闪烁液，德国PerkinElmer公司。2.3仪器设备电子分析天平、pH计，德国 Sartrious公司；CO 2细胞培养箱，德国 Thermo公司；超净工作台，北京半导体设备一厂；CK40倒置显微镜，日本 OLYMPUS 公司；恒温水浴箱（北京长安科学仪器厂）；DY89-型电动玻璃匀浆机，宁波新芝科器研究所；UV160-A型紫外分光光度计，日本岛津公司； 5415D型和 5810R型高速离心机，Eppendorf 公司； DYQ-II型多孔细胞样品收集器，上海医
