1、无患子提取液制备纳米银及其协同抗菌性研究 欧霖拱 福建省轻工业研究所 摘 要： 以无患子提取液为还原剂, 制备了含有纳米银的无患子复合抗菌液, 考察了无患子提取液用量、温度、硝酸银摩尔浓度等因素对纳米银形貌和粒径的影响, 并借助 UV-Vis 可见分光光谱、X 射线衍射 (XRD) 以及透射电子显微镜 (TEM) 对产物进行表征;通过抑菌环法探讨了复合抗菌液对大肠杆菌的抗菌活性。由UV-Vis 图谱可知, 复合抗菌液等离子体共振吸收峰 (SPR) 在 418 nm 左右, 说明该复合抗菌液中有纳米银的存在;XRD 图表明合成的纳米银为面心立方结构;TEM 图表明合成纳米银粒径为 1040 nm
2、。由此获得的含有纳米银的无患子复合抗菌液对大肠杆菌表现出显著协同抗菌活性, 抑菌圈直径变大。关键词： 无患子提取液; 纳米银; 抗菌; 作者简介：欧霖拱 (1969-) , 男, 高级工程师, 副所长。收稿日期：2017-07-25基金：福建省科技计划项目, 工业引导性 (重点) 项目 (2017H006) Synthesis of silver nanoparticles using Sapindus mukorossi extract and synergistic antibacterial activityOU Lin-gong Light Industry Institute of
3、Fujian Province; Abstract： Sapindus mukorossi extract was used as a reducing agent to synthesize silver nanoparticles (AgNPs) . The effects of amount of Sapindus mukorossi extract, temperature and the molar concentration of AgNO3 on the morphology and size of AgNPs were investigated. The AgNPs were
4、characterized by UV-Vis, XRD and TEM. The inhibition zone against Escherichia coli was used to evaluate the antibacterial activity of Sapindus mukorossi extract containing silver nanoparticles. The UV-Vis spectra showed typical surface plasmon resonance (SPR) at approximately 418 nm, indicative of t
5、he presence of AgNPs. X-ray diffraction analysis of AgNPs revealed the crystalline nature of the synthesized silver nanoparticles with face-centred cubic (FCC) geometry. The particle size of the nanoparticles synthesized was 1040 nm, as confirmed by TEM. Furthermore, the Sapindus mukorossi extract c
6、ontaining AgNPs had a synergistic effect of antimicrobial activity against Escherichia coli, leading to larger diameter of the inhibition zone.Keyword： Sapindus mukorossi extract; silver nanoparticle; antimicrobial activity; Received： 2017-07-25纳米银具有光谱杀菌性能, 其制备方法多样, 目前制备方法主要有物理法、化学法以及生物法1, 2, 其中化学法是
7、最常用的制备方法, 包括溶液-凝胶法、高温分解法、水热法等3,4, 但化学反应过程中经常使用有毒还原剂、封端剂或有机溶剂。近年来, 生物法利用植物生物还原银离子, 植物生物分子具有还原剂和保护剂双重作用, 过程绿色环保, 因此植物生物还原制备纳米银得到了关注。无患子提取液中含有的无患子皂苷是一种天然非离子型表面活性剂, 广泛存在于无患子果皮中, 具有杀菌和抗菌能力5;含有的生物碱、多糖及多酚活性成分, 可还原金属前驱体及保护金属纳米颗粒。尽管无患子皂苷本身具有抗菌能力, 但仍然无法满足生活中的抗菌要求。利用较为稳定的纳米银颗粒取代银离子作为无机抗菌材料添加剂, 在抗菌领域有着广阔的应用前景。目
8、前关于无患子提取液合成金属纳米颗粒报道还比较少, 笔者以无患子提取液为原料, 与纳米银进行复配, 将无患子提取液生物还原过程与纳米银制备过程耦合起来, 制备出复合抗菌液并对其进行表征, 同时研究其抗菌性能。1 实验部分1.1 主要试剂与仪器无患子提取液 (Sapindus mukorossi Extract, 以下简称 SE) , 福建省轻工业研究所;Ag NO 3 (w=99.9%) , 分析纯, 国药集团化学试剂有限公司;大肠杆菌, 厦门大学生命科学学院环境与应用微生物研究所;琼脂、酵母粉、牛肉膏、蛋白胨, 生化试剂, 广东环凯微生物科技有限公司。Evolution 220UV-Vis 可
9、见分光光度计, 美国赛默飞世尔科技公司;HH-4 数显恒温水浴锅, 国华电器有限公司;SW-CJ-1FD 超净工作台, 苏州净化设备有限公司;SPX-150B-Z 生化培养箱, 上海博迅实业有限公司;KQ5200DE 数控超声波清洗器, 昆山超声仪器有限公司;Tecnai F30 高分辨透射电镜, 荷兰 Philips 公司;XPert Pro X 射线衍射仪, 荷兰 PANaslytical B.V.公司。1.2 实验方法1.2.1 复合抗菌液的制备取一定量的无患子提取液于锥形瓶中, 将其置于一定温度油浴锅中, 预热 10 min 后加入一定浓度的 Ag NO3溶液, 磁力搅拌下反应 5 h
10、 即得含有纳米银的无患子液复合抗菌液。1.2.2 纳米银表征UV-Vis 可见分光光度计:将不同条件下制备的复合抗菌液稀释适当倍数后倒入石英比色皿中, 用可见分光光度计扫描, 扫描波长为 300800 nm, 扫描步长为1 nm, 观察其等离子共振吸收峰。X 射线衍射 (XRD) 分析:将所制得的复合抗菌液高速离心得黑色沉淀, 取出后放在培养皿中, 置于 60鼓风干燥箱干燥 12 h 后取一定量的样品磨至足够细小的粉末, 在特制的玻璃支架槽中压片, 用 X 射线衍射仪, 以 CuK 为辐射源 (=0.154 18 nm) , 电压 40 k V, 电流 30 m A 条件下, 1090扫描。透
11、射电子显微镜 (TEM) 观察:将所制得的复合抗菌液稀释到合适倍数, 用夹着铜网的镊子夹浸入到溶液中, 反复捞取数次, 直至铜网上附着有可见液滴。然后将镊子平放在实验台上, 自然风干。用场发射透射电镜在 300 k V 加速电压下对样品进行观察。1.2.3 抑菌环实验将滤纸用打孔器制成毫米圆片, 放在一次性培养皿中高温灭菌, 灭菌后常温干燥, 保存备用。超净实验台紫外光杀菌 5 min 后活化、分离数个大肠杆菌的菌落, 置于 15 m L 灭菌后的超纯水中制成菌悬液。在无菌条件下, 将培养基倒入灭菌培养皿中, 待培养基完全凝固后, 取定量菌悬液于培养基表面, 涂匀, 备用。将若干灭菌圆滤纸片分
12、别浸没在反应后的含纳米银的无患子皂苷溶液、不含纳米银的无患子皂苷溶液中, 在无菌条件下将圆滤纸片捞出, 贴于载有大肠杆菌的平板上, 培养 24 h 后观察抑菌圈大小。2 结果与讨论2.1 产物的表征2.1.1 UV-Vis 吸收光谱图 1 为不同用量的无患子提取液 (5.0, 10.0 和 15.0 m L) 在 70下加入 3.72 mmolL Ag NO3溶液, 磁力搅拌反应 5 h 所得复合抗菌液的 UV-Vis 吸收光谱图。由图 1 可知, 纳米银颗粒在 UV-Vis 吸收光谱上具有比较明显的表面等离子体共振吸收峰 (SPR) , SPR 峰依次为 421, 418 和 422 nm,
13、 这表明有纳米银形成。当无患子提取液的体积为 10 m L 时, SPR 峰有蓝移现象, 一般在同种溶液里, 吸收峰蓝移表明粒径变小, 因此可以看出无患子提取液的体积为 10 m L 时纳米银的粒径最小;当无患子提取液加入量为 15 m L 时 SPR 峰出现红移, 可能是因为随着无患子皂苷的增加, 影响了纳米银粒径。图 1 不同无患子提取液用量下制备纳米银 UV-Vis 吸收光谱 Fig.1 UVvis absorption spectra of Ag NPs synthesized with different amount of Sapindus mukorossi extract 下载
14、原图图 2 为不同温度 (60, 70 和 80) 下加入 10 m L 无患子提取液与 3.72 mmolL Ag NO3溶液, 磁力搅拌反应 5 h 所得复合抗菌液的 UV-Vis 吸收光谱图。从图 2 可以看出, 随着反应温度升高, 纳米银吸收峰强度随之升高, 说明高温下还原速率较快, 得到更多纳米银。升温至 80, 由 TEM 图 (图 5) 可知, 合成的纳米银颗粒几乎都是球形或近球形形貌, 这表明在高温下反应速率较快, 纳米银颗粒趋于各向同性生长, 生成球形或近球形形貌。在温度和无患子提取液用量相同时, 加入不同摩尔浓度 Ag NO3溶液, 磁力搅拌反应 5 h 所得复合抗菌液的
15、UV-Vis 吸收光谱图见图 3。从图 3 可以看出, 随着硝酸银摩尔浓度增大, 复合抗菌液的吸收峰增强, 但随着硝酸银摩尔浓度增加, 生成的纳米银可能发生一定的团聚, 影响其在无患子提取液中的分散性。因此, 实验选取 Ag NO3摩尔浓度为 3.72 mmolL。图 2 不同温度下制备纳米银 UV-Vis 吸收光谱 Fig.2 UVvis absorption spectra of Ag NPs synthesized at different temperature 下载原图图 3 不同 Ag NO3 用量下制备纳米银 UV-Vis 吸收光谱 Fig.3 UVvis absorption
16、spectra of Ag NPs synthesized with different concentrations of Ag NO3 下载原图2.1.2 XRD 和 TEM将制备的复合抗菌液提取出纳米银颗粒并进行 XRD 表征, 实验结果见图 4。由图 4 可知, 38, 44, 64和 77分别为单质银 (110) 、 (200) 、 (220) 和 (331) 面的特征衍射峰, 说明无患子提取液成功还原硝酸银得到面心立方结构银晶体。从图 5 可以看出, 当无患子提取液体积为 10 m L、温度为 80、硝酸银摩尔浓度为 3.72 mmolL 时, 制备出的纳米银粒径为 1040 nm
17、。图 4 纳米银颗粒的 XRD 图 Fig.4 Powder XRD pattern of Ag NPs 下载原图图 5 纳米银颗粒的 TEM 图 Fig.5 TEM images of Ag NPs 下载原图2.2 抑菌性能图 6 为不同样品的抑菌圈, 其中 a 为去离子水, 抑菌圈直径为 6 mm;b 为无患子皂苷液, 抑菌圈直径为 11.5 mm;c 为含纳米银的无患子皂苷液, 抑菌圈直径为13.5 mm。从图 6 可以看出, c 的抑菌圈直径最大, 抑菌性最强。实验表明, 将无患子提取液与纳米银复配所得复配抗菌液, 对大肠杆菌具有协同抑制作用。图 6 不同样品的抑菌圈 Fig.6 In
18、hibition zone of different samples 下载原图3 结论1) 采用无患子提取液与硝酸银溶液制备了纳米银复合抗菌剂, 并考察了无患子提取液体积、温度、硝酸银摩尔浓度等因素对合成纳米银的影响。实验表明, 当无患子提取液体积为 10 m L、温度为 80、硝酸银体积为 3.72 mmolL 时, 所得纳米银粒径为 1040 nm。2) 通过抑菌实验, 得出含有纳米银的复配抗菌液杀菌能力更强, 对大肠杆菌具有协同抑制作用, 在医用洗涤方面具有很好的应用前景。参考文献1CHERNOUSOVA S, Epple M.Silver as antibacterial agent:
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