1、细菌形态与结构的检查法适用对象 中医学（骨伤方向） 、针灸推拿学专业实验学时 3 学时一、实验目的1、学会显微镜油镜的使用和保护方法。2、认识细菌的基本形态和特殊结构(荚膜、鞭毛、芽胞)。3、掌握革兰氏染色方法。4、了解细菌的动力。二、实验原理1、显微镜油镜的使用原理: 观察细菌必须用放大1 000倍左右的油镜。油镜的透镜极小，工作焦距最短,光线通过玻璃和空气，由于介质密度不同发生折射，射人镜筒的光线极少，视野暗、物象不清晰。如在玻片与镜头（透镜）之间加上折光率和玻片（n=1.52）相近的香柏油（n=1.515）就可减少光线的折射，加强视野的亮度，获得清晰的物像。2、革兰染色法的原理：主要是革
2、兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁有差异，另外革兰阳性菌的等电点比革兰阴性菌低，与碱性染料的亲和力强。三、仪器设备1、显微镜2、细菌标本片：(1)葡萄球菌(革兰染色)(2)大肠杆菌(革兰染色(3)霍乱弧菌(革兰染色)(4)伤寒杆菌(鞭毛染色)(5)肺炎球菌(荚膜染色(6)破伤风杆菌(芽胞染色)萄球菌、绿脓杆菌的琼脂斜面1824小时培养物。4、染色液有结晶紫、碘液、95酒精、稀释石炭酸复红。四、相关知识点细菌是一类体积微小的单细胞原核细胞型微生物，活的菌体小而透明，当把细菌悬浮于水滴内，用普通光学显微镜观察时，由于菌体和背景没有显著的明暗差，因而难以看清它们的形态，更不易是别其结构，所以，用普通光学显微
3、镜观察细菌时，往往要先将细菌进行染色，借助于颜色的反衬作用，可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构。因此，为了研究细菌的形态特征和鉴别不同类群的细菌，细菌的染色及形态构的观察是位生物学实验中十分重要的基本技术。五、实验步骤显微镜油镜的使用显微镜使用方法将显微镜平稳的安放在试验台适宜处用低倍镜对光，调节反光镜，天然光源用平面反光镜，人工光源或光线较弱使用凹面反光镜。检查染色标本要用强光，应将聚光器升到最高，光圈完全开大；若检查未染色的活体标本则用弱光，聚光器适当下降，光圈适当缩小。标本片上加镜油一滴，转动粗螺旋，使油镜头缓缓下降，用眼从侧面观察，直到油镜头浸入油中接近玻片为止(注意下降油镜头
4、时不要用力过猛过急，以免压碎玻片或损坏镜头)。用左眼从接目镜观察，徐徐转动粗螺旋提升镜头，见模糊物像后再用细螺旋调节即见到清晰物像为止。油镜头使用后应立即用擦镜纸擦净镜头上的油。如油已干，可在镜头纸上滴少许的二甲苯擦拭，并立即用干的擦镜纸擦去二甲苯，因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜片脱落，所以应及时擦去二甲苯。显微镜的保护显微镜是精密仪器，使用时要精心保护，不得随意拆散和碰撞，所有光学部分都不能用手指、布、普通纸擦拭。 取送显微镜时应右手持镜臂，左手托镜座，平端于胸前。显微镜的光学部分应避免日光直射。不用时，将接物镜转开成八字降至最低，使其不对准聚光器，聚光器下降，罩上镜套或放到显微镜箱中
5、。观察细菌的基本形态与特殊结构1、用油镜观察下列细菌的示教片(1)葡萄球菌(革兰染色) (2)大肠杆菌(革兰染色 (3)霍乱弧菌(革兰染色)(4)伤寒杆菌(鞭毛染色)(5)肺炎球菌(荚膜染色 (6)破伤风杆菌(芽胞染色)注意：各菌的形态、排列和染色性以及特殊结构特点等性状。2、将观察到的结果，画在报告纸上并加以适当的描述。注意：微生物标本片，多用涂片法制成，观察完毕，不能用力擦去玻片上的镜油，只能用擦镜纸轻轻压吸或滴一滴二甲苯用擦镜纸轻拉。示教片看完处理后应放回原处，自己涂的玻片看完后应放入消毒缸内。革兰染色法1、细菌标本片的制作(1)涂片：无菌操作。取一接种环生理盐水放于载玻片的一端，用接种
6、环刮取少许绿脓杆菌或葡萄球菌培养物与盐水混匀，涂布成直径约lcm的涂片(若采用液体培养物，勿加生理盐水，直接采取12环菌液即可)。涂片应薄而均匀。(2)干燥：涂片最好在温室中自然干燥。必要时可将标本面向上，在酒精灯上方微火处借热收干。(3)固定：标本面向上，在酒精灯火焰外层按钟摆的速度来回通过3次。放置待冷后，进行染色。固定的目的是杀死细菌，使细菌与玻片粘附较牢，在染色时不致于被染液和水冲掉；另外固定能使细菌蛋白质变性，提高细菌对染料的亲和性。2、染色(1)初染：滴加结晶紫染液于涂片上，1分钟后用自来水缓缓冲洗。(2)媒染：滴加碘液，1分钟后用自来水缓缓冲洗。(3)脱色：加95酒精，边摆动玻片
7、使酒精流去边观察，直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色时为止(约2030秒钟)，及时用自来水缓缓冲洗。(4)复染：滴加稀释石炭酸复红液，30秒1分钟后用水缓缓冲洗。自然干燥或用吸水纸吸干后，加一滴香拍油，油镜检查，注意观察菌体的形态、排列及染色性。六、实验报告要求根据染色观察结果，绘出两种细菌的形态图。七、思考题1、你的染色结果是否正确？如果不正确，请说明原因。2、你认为革兰氏染色中，哪一个步骤可以省去而不影响最终结果？在什么情况下可以采用？八、实验成绩评定办法主要评分点：原理描述（10%） 、实验流程（20） 、调试过程（10） 、数据记录（10） 、解决问题的能力（20） 、资料搜集（10） 、实验结果（10） 、实验效果（10） 。
