1、苜蓿皂甙对胆固醇排泄和内皮细胞释放一氧化氮的影响刘 凯 余书勤(病理生理学教研室 221002) (中国药科大学药理研究室 )摘要 目的 研究苜蓿皂甙对实验大鼠胆固醇排泄和人脐静脉内皮细胞释放一氧化氮 (NO) 的影响。 方法实验动物分为正常对照组、高胆固醇血症组、氯贝特 (又名安妥明 )阳性对照组和苜蓿皂甙组。测定各组肝脏胆固醇、胆汁总胆酸和胆汁胆固醇含量的变化 ;测定粪便中固醇净排出量的变化并比较分析。内皮细胞分为正常对照组和苜蓿皂甙处理 1 h、 2 h、 4 h 组。测定各组内皮细胞释放 NO 含量的变化并比较分析。 结果 与高胆固醇血症组比较 ,苜蓿皂甙组肝脏胆固醇显著降低 ,胆汁总
2、胆酸含量显著增加 ;苜蓿皂甙组粪便中总固醇和酸性固醇净排出量均显著增加。与正常对照组比较 ,苜蓿皂甙处理 1 h、 2 h、 4 h 各组 NO 的释放均显著增加。 结论 苜蓿皂甙能够明显促进实验大鼠胆固醇的排泄 ;促使正常培养内皮细胞 NO 的释放。提示苜蓿皂甙可能是一种远期疗效较好、并能促使动脉粥样硬化斑块消退的降脂药物。关键词 苜蓿皂甙 胆固醇排泄 一氧化氮中图分类号 R363. 2 + 1 R972 + . 6EFFECTS OF ALFALFA SAPONIN ON RAT CHOLESTEROL EXCRETION ANDNITRIC OXIDE RELEASE FROM ENDO
3、THELIAL CELLSLiu Kai , Yu Shuqin(Department of Pathophysiology ,Xuzhou Medical College ,Xuzhou ,Jiangsu 221002 ,China)ABSTRACT Objective To study the effects of alfalfa saponin on rat cholesterol excretion and nitric oxide(NO) releasefrom human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) . Methods The
4、liver and bile cholesterol ,total bile acid and the choles2terol excretion in the experimental hypercholesterolemic rats were determined. The level of NO was observed in HUVEC.ResultsCompared with hypercholesterolemia group ,the liver cholesterol was significantly reduced( P 0. 01) ,the total bile a
5、cid inbile was significantly increased( P 0. 01) and the total steroids and acidic steroids in feces were significantly increased in alfal2fa saponin group. Compared with normal control , the NO release of HUVEC was significantly increased in Alfalfa saponin groupafter treatment for 1 h ,2 h or 4 h.
6、 Conclusion Alfalfa saponin can increase the cholesterol excretion in experimental rats andthe NO release in HUVEC. Alfalfa saponin might be a promising hypocholesterolemic drug.KEY WORDS Alfalfa saponin Cholesterol excretion Nitric oxide苜蓿 (medicago sativa L)饮食能防止实验动物的高胆固醇血症和动脉粥样硬化形成 ,也能降低实验动物的高胆固醇
7、血症并引起动脉粥样硬化斑块的消退 1 。苜蓿的这种作用被认为主要是由其中的苜蓿皂甙 (alfalfa saponin) 所引起 2 。我们以往的研究表明 ,苜蓿皂甙能显著降低高胆固醇血症大鼠的血清胆固醇 , 明显促进非受体途径对低密度脂蛋白(LDL) 的清除 ,为寻找治疗家族性高胆固醇血症(FH)的有效药物 ,提示了较有意义的途径 3 。根据胆固醇在体内代谢的特点 ,远期疗效好的降脂药物应该能促进胆固醇自体内清除。为此 ,我们测定苜蓿皂甙对胆固醇排泄的影响。由于高脂血症可以造成血管内皮细胞一氧化氮 (NO) 系统的损害 ,从而导致动脉粥样硬化的发生 ,我们还研究了苜蓿皂甙对血管内皮细胞释放 N
8、O 的影响 ,试图阐明苜蓿皂甙引起动脉粥样硬化斑块消退的机制。1 材料和方法1. 1 实验动物和分组 SD 雄性大鼠 ,体重 160200 g。实验室内普通饲料喂养 3 5 d ,随机分为正常对照组 (NC) 、高胆固醇血症组 (HC) 、氯贝特 (又名安妥明 )阳性对照组 (CC) 和苜蓿皂甙组 (AS) 。测定各鼠血清总胆固醇 (TC)含量。正常对照组喂普通饲料 ;高胆固醇血症组饲料为 :普通饲料中加入 10 %猪油、 2 %胆固醇、 0. 2 %胆酸钠和 0. 1 %甲基硫氧嘧啶 ;氯贝特组饲料为在高胆固醇血症组饲料中加入氯贝特 (沈阳市新城子制药厂产品 ) ,剂量为 100 mg/ d
9、 ;苜蓿皂甙组饲料为高244 徐州医学院学报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE XUZHOU 1999 ,19(6)胆固醇血症组饲料中加入苜蓿皂甙浸膏粉 ,剂量为1 g/ d。实验期间饲料投喂量 20 g/ d ,自由饮水。1. 2 粪便固醇净排出量测定 实验 4 周后 ,将各鼠分放入代谢笼 ,每日定量给予饲料 ,收集 3 d 粪便。按改良 Child 气相色谱法 4 ,取干燥食物和粪便各0. 1 g ,用氯仿甲醇 (2 1 , V/ V ) 液抽提 ,加入内标准 (heptadecanoic 和 5 - cholestane ,Sigma) ,经丁酯化和乙酰化处理后 ,行气相
10、色谱测定。标本中中性和酸性固醇含量以测量出的各成分峰高参考内标准峰高计算得出。总排出量减去总摄入量为净排出量(以体重计 ) ,以 mg 100 g - 1 d - 1表示。1. 3 肝脏和胆汁胆固醇含量测定 乙醚麻醉动物 ,经胆管插管收集 1 h 胆汁。处死动物并迅速取出肝脏称重。取 1 g 肝组织匀浆 ,用氯仿甲醇 (2 1) 抽提脂质 ,酶法测定胆固醇含量 (以肝组织重计 ) ;胆汁总胆酸测定采用洪南康方法 5 (以体重计 ) ;胆汁胆固醇按 Bolton 方法 6 抽提 ,再用酶法测定 (以体重计 ) 。1. 4 内皮细胞培养 常规培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC) 7 。用含 20 %
11、胎牛血清 M199 培养在 6 孔板中 ,至细胞融合时开始实验。1. 5 苜蓿皂甙对内皮细胞释放 NO 的时效关系 苜蓿皂甙加无菌三蒸水 (每克加水 5 ml) 制备浸出液。实验分正常对照组和苜蓿皂甙 1 h、 2 h、 4 h 组(每孔加入苜蓿皂甙浸出液 1. 0 ml) 。各组于相应时间收集条件培养液用于测定 NO。1. 6 NO 测定 用改良 Green 方法 8 测定 ,标本与Griess 试剂反应后 ,在 550 nm 波长处测样品吸收值。样品的 NO 浓度从已知浓度的亚硝酸钠标准曲线上换算得出。 NO 浓度单位以 mol/ L 表示。1. 7 统计学处理 数据以 x s 表示 ,统
12、计学处理采用 Student t 检验。2 结 果2. 1 肝脏、胆汁中胆固醇含量 表 1 显示 ,AS 组和CC组肝脏胆固醇含量显著低于 HC 组。 AS 组胆汁中总胆酸含量显著增加 ;胆汁中胆固醇含量有增加趋势 ,但无统计学意义。2. 2 粪便固醇净排出量 表 2 显示 ,与 HC 组比较 ,AS组粪便中总固醇和酸性固醇净排出量显著增加 ,而中性固醇含量无明显变化。 CC 组粪便中各成分均无明显变化。表 1 苜蓿皂甙对肝脏胆固醇、胆汁总胆酸和胆固醇含量的影响组 别 n 肝脏胆固醇 (mg/ g) 总胆酸 (mg 100 g- 1 h - 1) 胆汁胆固醇 ( g 100 g- 1 h -
13、1)NC 7 20. 06 1. 91 6. 01 1. 26 23. 41 2. 07HC 6 23. 85 3. 09 5. 09 1. 03 24. 45 2. 42CC 6 17. 98 1. 93 3 3 4. 99 0. 59 24. 38 2. 75AS 7 17. 35 1. 85 3 3 8. 16 1. 00 3 3 26. 96 1. 93与 HC组比较 : 3 3 P 0. 01表 2 苜蓿皂甙对粪便固醇净排出量的影响 (mg 100 g- 1 d - 1)组 别 n 总固醇 中性固醇 酸性固醇HC 7 20. 25 2. 60 14. 93 1. 81 7. 13 1
14、. 60CC 7 21. 26 2. 98 12. 75 2. 02 8. 24 1. 51AS 8 24. 75 3. 48 3 13. 34 1. 80 12. 95 2. 13 3 3与 HC组比较 : 3 P 0. 05 , 3 3 P 0. 012. 3 NO 含量 表 3 显示 ,与 NC 组比较 ,内皮细胞培养液中加入苜蓿皂甙浸出液 1 h 后即可见 NO 显著升高。至 4 h 时虽有下降趋势 ,但仍显著高于 NC组。表 3 苜蓿皂甙对内皮细胞释放 NO 的影响 ( mol/ L , n = 6)指 标 NC AS 1 h 2 h 4 hNO 8. 43 0. 91 11. 26
15、 2. 32 3 11. 21 2. 39 3 10. 44 1. 84 3与 NC组比较 : 3 P 0. 05344 徐州医学院学报 ACTA ACADEMIAE MEDICINAE XUZHOU 1999 ,19(6)3 讨 论由于哺乳动物组织内缺乏分解固醇核的酶 ,因而 胆固醇不能像其他代谢物那样转变为二氧化碳和水。胆固醇自体内排出的惟一途径是在肝细胞内转变为胆汁成分 ,然后经肠道排出。因此 ,在实验研究的基础上我们提出 ,能否促进胆固醇自体内排出 ,应当作为评价一种降脂药物远期疗效好坏的重要指标 9 。我们在药物治疗 FH 可能性的研究中发现 ,能够促进 LDL 经非受体途径 (单核
16、巨噬细胞系统 ) 降解 ,并促进胆固醇自体内排出的药物 ,对纯合子 FH患者治疗有效 9 。苜蓿皂甙能够促进 LDL 经单核巨噬细胞系统降解 ,因此在本实验中我们研究了苜蓿皂甙对胆固醇自体内排泄的影响。实验表明 ,AS组肝脏胆固醇较 HC 组明显减少 ,而胆汁总胆酸含量显著增加 ,说明苜蓿皂甙可以使肝脏胆固醇大量转变为胆汁酸。推测这种作用可能是由于苜蓿皂甙增强肝细胞内 7 - 羟化酶的活性所致。正常情况下 ,胆汁酸在肠道内主要通过肠肝循环被重吸收入肝脏 ,少部分经粪便排至体外。实验结果表明 ,AS组粪便中总固醇和酸性固醇净排出量较 HC 组显著增加 ,说明苜蓿皂甙可能具有阻断胆汁酸肠肝循环的作
17、用 ,从而能够促进胆固醇自体内排出。NO 在维持血管稳态上具有关键的作用。 NO 能够通过抑制白细胞的活化和粘附、防止血小板粘附聚集、抑制平滑肌细胞的增殖和防止泡沫细胞的形成等途径 ,来抑制动脉粥样硬化的形成 10 。动脉粥样硬化的早期事件之一是内皮功能障碍 (其发生可在无任何可见的内膜增厚之前 ) ,而内皮功能障碍的主要特征就是 NO 活性的减弱 11 。因此 ,有学者认为 NO/ cGMP 信号转导系统可能是阻止动脉粥样硬化发生、发展的新的治疗途径。我们的实验表明 ,加入苜蓿皂甙浸出液 1 h 后 ,内皮细胞释放 NO 明显增加。说明苜蓿皂甙可能具有通过促进内皮细胞释放NO ,而阻止动脉粥
18、样硬化形成的作用 ,从而部分说明了苜蓿皂甙引起动脉粥样硬化斑块消退的机制。但苜蓿皂甙对高脂环境下培养的内皮细胞是否也具有类似的作用 ,有待进一步研究。参 考 文 献1 Malinow MR , McLaughlin P , Naito HK, et al. Effect of alfalfa meal onshrinkage (regression) of atherosclerotic plaques during cholesterol feed2ing in monkeys. Atherosclerosis , 1978 , 30 (1) :272 Malinow MR , McLaug
19、hlin P , Stafford C , et al. Alfalfa saponins and al2falfa seeds - dietary effects in cholesterol - fed rabbits. Athero - sclero2sis ,1980 , 37 (3) :4333 刘 凯 ,庞庆丰 ,周 范 ,等 . 苜蓿皂甙对血胆固醇和 LDL 清除非受体途径的影响 . 徐州医学院学报 , 1995 , 15 (2) :1184 Child P ,Aloe M ,Mee D. Separation and quantitation of fatty acids ,s
20、terols and bile acids in feces by gas chromatography as the butyl ester -acetate derivatives. J Chromatogr , 1987 , 415 (1) :135 洪南康 . 磷钼酸比色法测定胆汁中总胆酸 . 上海医学 , 1983 , 6(1) :356 Bolton CH ,Low - Beer TS ,Pomare EW ,et al. A simplified procedurefor the analysis of cholesterol - phospholipids and bile s
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