1、中国强譬警蓐跑CHINJFORENSICMED 2006年第21卷第5期激光捕获显微分离技术及其法医学研究进展陈连康，顾丽华(上海市刑事科学技术研究所，上海200083)综 述【摘要】激光捕获显微分离技术(1aser capture nficrodisseetion，LCM)是一项显微捕获分离单个细胞和多个细胞的自动化新技术，本文综述了其在法医学领域的研究新进展。经过研究和实践，它将在法医学实践中解决混合和微量物证的DNA检验难题中发挥重要作用。【关键词】法医物证学；LCM；法医学应用；混合和微量物证【文献标识码】A 【文章编号】1001-5728(2006)05028902Technolog
2、y and application of the lar capture microdissection in forensic sciencefCHEN Lian-kang，GU Li-huaShanghai Inst如ute of Forensic Science，Shanghai 200038，China)【Abstract】Laser capture microdissection(LCM)is a newly automatic technology，which providesan approach to microdissecting individual eeHs or muh
3、icellular structuresThe review summarized thenew advances in forensic appHcafions of laser capture mierodissectionIn the field of forensic science，itwill play an important role in solving the problem of DNA analysis for the mixed stain or the trace evidence【Key words】Forensic biological evidence；LCM
4、；Forensic Application；Mixed or traced evidence随着生命科学技术发展不断精细化，其研究范围从离体细胞扩展至在体研究，许多情况下需要对生物组织的不同组份或不同细胞进行分别研究，如何从复杂、不均一的生物样品中获得所期望的均一性、更接近于活体状态的组份，成为实验技术上亟需解决的主要问题之一，激光捕获显微切割技术(1aser capture mierodissection，LGM)就是应其而产生的新技术。1 激光捕获显微切割技术(LCM)的历史【l】显微切割技术的发展过程大致经历手工显微切割，显微操纵器切割，激光束(1aser mierobeam)切割，以及
5、激光捕获显微切割等几个阶段，每一个阶段的发展都在准确性、速度以及效率等指标方面有很大的提高。90年代中期发展起来的LCM能够快速准确的从复杂组织中分离均一的样品组份，从而为后续的研究工作奠定基础。LCM技术始创于美国国立卫生研究院(NIH)，它是用红外光作为激光光源。脉冲激光作用到一种紧贴于样品表面的热塑性EVA(ethylene vinyl accetate)膜，使膜加热融化(熔点80)，融化的EVA膜向样品内膨胀，与目的标样品共同凝固而捕获样品，最后分离出目标样品，整个操作过程在显微镜下进行。2 LCM的原理嵋1LCM是一种快速和容易操作的激光显微捕获方法，从标准的组织切片中用低能的红外激
6、光激活一种特殊的热塑料膜上的目标细胞和组织，被活化的转移膜粘住处于激光束直径【作者简介】陈连康(1952一)，男，浙江宁波人，主任法医师，主要从事刑事技术管理，法医学和法医物证学研究工作。下的细胞的技术，从而提供了从含有组织或细胞样品切片上显微捕获单个细胞和多个细胞结构的自动化途径。目前国际上常用的是德国PALM公司的LCM显微切割仪和美国Arctums公司的Veritas激光显微捕获系统。德国PALM公司的LCM技术是在传统LCM技术的基础上运用激光压力弹射(LPC)技术来实现对样品切割与分离的一步连续完成。其方法是：样品制备在普通载片(厚lmm)或特殊载片(厚017mm)上，样品经染色处理
7、后，目标组份被染成在光镜下可见的有别于周围其他组织细胞的颜色，显微视野通过摄像机显示在电脑屏幕上，选中目标组份，软件按设定好的相应参数把选中组份先沿边界切割，然后在激光脉冲压力作用下弹射到收集帽中，从而获得均一性的目标样品。美国Arcturus公司的VERITAS激光显微分离系统，是在近红外激光捕获显微分离(LCM)技术基础上，增添紫外激光显微分割技术，既有近红外捕获，又可以紫外显微切割，具有捕获方式灵活，分离速度快，自动化程度高的特点。该技术对样品的分离是基于红外激光对热塑性EVA膜的加热融化，融化后的膜膨胀渗入样品中与目标组份共同凝固而捕获目标组份，最后两者被分离。LCM的操作过程基本上是
8、软件控制的，整个操作过程在显微镜下进行，操作者在屏幕上直观选取目标样品，具有“所见即所得”的特点。由于样品切割和分离的工具由激光取代传统的显微探针和刀片，故可以有效地减少样品组份间的交叉污染。一旦选好目标组份之后，其切割与分离过程可在几秒内完成，LCM可以切割直径约7仙m或更小的显微结构。3 LCM的特点1与传统的显微切割以及其他分离、收集技术相比，LCM具289中国浩譬警暴跑CHINdFORENSICIVIED 2006年第21卷第5期有快速简单、高效、直观，能有效减少样品交叉污染的特点，同时还能基于组织或细胞的表型或功能特征，结合免疫组化技术进行切割分离，既能有效保持被分离样品结构的完整性
9、，又能不破坏周围临近组织的结构和组织特性。近红外激光能量低，其波长远离生物组织的吸收峰，能最大限度地保护生物大分子的完整性，适合用来捕获单细胞和少量细胞，具有安全、快速的特点。LCM技术适用于组织冰冻切片、石蜡包埋切片、滴片和涂片等多种制片形式。这对于在体方面的研究十分有利。4 LCM在法医学领域应用的最新进展H1由于激光捕获细胞的针对性极强，可以从复杂的组织样品中获得微量靶细胞，对于法医学检验有重要意义。对于微量口腔上皮细胞中混有杂质或干扰物质的样品，采用此技术即能有效地获得所需靶细胞，使一般方法难以检验的样品成功进行STRDNA检测，同时也对低拷贝DNA的分析提供了一个自动化、快速和有效的
10、途经。此外，因为LCM具有从复杂组织中快速、准确地分离均一性样品组份的优点，所以在病理学、肿瘤生物学的研究领域也具有广泛的应用价值口1。LcM在国内法医学领域应用的报道不多。周怀谷等1报道了25个阴道上皮细胞和100个精子细胞，通过激光捕获显微切割技术获得后进行STRDNA分型检测获得成功。近年来，LCM在国外也有一些研究应用于法医学领域。Martino等ou报道了从组织样品中分离单细胞和进行个体识别，具有法医学和病理学应用价值，这些样品的STR分型检测结果在法庭上作为个体识别的重要证据。在此研究中，极微量的毛囊细胞被大量角蛋白包裹着，降低了DNA扩增的效率，采用LCM大大提高了选取单细胞的能
11、力而避免污染。报道中采用了Leica AS LMD仪(1eica microsystems，germany)切割毛发末端的毛囊，特异地收集毛囊部分，以避免角蛋白的干扰，提取出毛囊中适量DNA，并成功地进行了STR分型。Martino等旧1报道：通过Leica AS LMD仪收集涂片上的多个单精子细胞，并进行STR分型检测获得成功。采用传统方法提取阴道细胞混合物中的精子细胞，通常在精子DNA数量大于250pg时有效，而阴道涂片上的精子则难以进行常规DNA分析，Elliott等一3报道采用LCM将精子从含有阴道细胞的涂片上捕获下来，这对于重要的性侵犯凶杀案或强奸案显得尤其重要。文中将常规方法和LC
12、M方法作了比较，16个样品中有15个采用LCM方法获取精子的结果证明其具有优越性。在实际案件中，对阴道涂片以及陈年积案的涂片均能获得成功的应用。文中一共对77张含有精子的涂片进行了应用研究，证实此项技术的良好效果。Robino1驯、Bauer、Reshef121等报道了从与母体混合的胎儿绒毛膜组织、福尔马林固定以及石蜡包埋的胎儿组织中，应用LCM进行相关细胞捕获，进行DNA的STR分型，用于认定胎儿生物学父亲的成功案例。BudimlijaH副等报道两例性侵犯导致怀孕案例，在被害人怀孕3个月内进行流产手术，分别从绒毛膜石蜡包埋块和胎儿组织切片中，应用LCM获得胎儿细胞，成功进行STR基因分型，证
13、实亲子关系，将罪犯绳之以法。2905小节LCM是90年代中期发展的新技术，在国外医学和研究领域已被广泛应用，但在法医学领域应用尚不多。根据LCM的原理和实践，针对法医生物物证检验常面对混合物证和微量物证的特点，经过法医生物检验技术人员的研究和实践，LCM必然会在解决混合和微量物证的DNA检验中发挥重要作用。【参考文献】1郭福政，丘淑兰，肖雪嫒，等LCM激光捕获显微技术及其应用J现代仪器，2003，1：40-422Bonner R FLaser capture microdissection of single cellsfrom complex tissuesJBiotechniques，19
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