1、基于代谢组学的芩百清肺浓缩丸治疗支原体肺炎小鼠的作用机制研究 魏文峰 刘烨 霍金海 王伟明 黑龙江省中医药科学院 摘 要： 目的 研究芩百清肺浓缩丸治疗支原体肺炎的作用机制。方法 采用超高效液相色谱与串联四级杆飞行时间质谱 (UPLC-Q-TOF-MS) 联用技术的代谢组学方法, 分析肺炎支原体感染小鼠肺组织中内源性化合物的变化。采用 Progenisis QI软件进行色谱峰识别及匹配, 并采用主成分分析 (PCA) 和偏最小二乘-判别分析 (PLS-DA) 对获得数据进行降维, 通过分析对不同组间分离贡献度较大 (VIP1, P 1, P 1) , 结合 t 检验的 P 值 (0.05) 来
2、寻找差异性表达代谢物, 结合公共网络数据库 (HMDB、Metlin) 检索, 对代谢物进行结构鉴定, 通过代谢途径数据库 KEGG 和 Metabo Analyst 检索, 结合相关文献、生物化学及分子生物学知识, 探讨潜在生物标志物的相关生物学意义。3 结果3.1 小鼠肺组织病理变化小鼠肺组织病理切片评分系统由 1 个 026 分的评分系统组成11, 5 个分类评价系统由管腔周围浸润而致的细支气管和支气管的数目、管腔周围浸润的程度、管腔内渗出的严重度、血管周围浸润的频度、实质性肺炎的严重度合并后记分, 每张切片选择 5 个视野评分。对照组小鼠肺组织可见肺泡结构清晰, 肺泡壁薄, 未见炎性细
3、胞浸润, 上皮细胞状态良好 (图 1、表 1) ;模型组小鼠肺组织支气管形态中度改变, 管腔有大量分泌物, 肺泡上皮坏死, 边缘模糊, 肺泡壁增厚、水肿、脱落, 气管支气管周围及其腔内、血管周围及肺泡腔内伴以淋巴细胞为主的炎性细胞浸润, 病变面积较大;QQCP 组小鼠肺组织支气管症状明显改善, 上皮细胞恢复良好, 肺泡水肿减轻, 边缘逐步清晰, 病变面积明显减少;阿奇霉素组小鼠肺组织支气管症状轻微改善, 整体未见明显改善。3.2 代谢组学研究3.2.1 小鼠肺组织代谢轮廓分析采用 UPLC-Q-TOF-MS 法进行肺组织样本的分离与数据采集, 并对数据进行 PCA和 PLS-DA, PCA 在
4、正、负离子模式下的得分图见图 2, 经造模后, 模型组小鼠肺组织中的内源性代谢物与对照组相比发生了明显的变化, 经 QQCP 治疗后, 代谢轮廓向着对照组方向改变。3.2.2 潜在生物标志物的表征为进一步区分各组差异, 对对照组、模型组和 QQCP 组小鼠肺组织代谢物进行有监督的 PLS-DA, 正离子模式的模型参数为 R=0.96, Q=0.92, 负离子模型参数为R=0.92, Q=0.88, 结果见图 3。结果显示所构建模型有效, 可用于后续组间差异成分的寻找及分析。从图 3 中可以看出模型组与对照组具有很好的区分, 负离子模式下 QQCP 组与对照组极为接近并有部分重叠。通过 VIP
5、值并结合 t 检验 (P0.05) 寻找差异性表达代谢物, 得到 20 个差异生物标志物 (表 2、3) 。图 1 各组小鼠肺组织病理学观察结果 (10, HE) Fig.1 Pathological detection of lung tissue of mice in each group (10, HE) 下载原图表 1 各组小鼠肺组织病理评分 (s, n=10) Table 1 Histolugical score of lung tissue of mice in each group (s, n=10) 下载原表 图 2 对照、模型和 QQCP 组小鼠肺组织正离子模式 (A) 和负
6、离子模式 (B) 代谢轮廓 PCA 得分 Fig.2 PCA score plots of lung tissue metabolic profiling of control group, model group, and QQCP group in positive mode (A) and negative mode (B) 下载原图图 3 对照、模型和 QQCP 组小鼠肺组织正离子模式 (A) 和负离子模式 (B) 代谢轮廓 PLS-DA 得分 Fig.3 PLS-DA score plots of lung tissue metabolic profiling of control
7、group, model group and QQCP group in positive mode (A) and negative mode (B) 下载原图表 2 QQCP 治疗小鼠 MPP 的潜在生物标志物 (正离子模式) Table 2 Potential biomarkers in MPP mice treated by QQCP (positive mode) 下载原表 表 3 QQCP 治疗小鼠 MPP 的潜在生物标志物 (负离子模式) Table 3 Potential biomarkers in MPP mice treated by QQCP (negative mode
8、) 下载原表 与对照组比较, 模型组小鼠肺组织中维 A 酸、视黄醛、焦谷氨酸、白三烯 C4、前列腺素 E2 等 10 个潜在标志物水平升高, 而胆绿素、花生四烯酸、亚油酸、11, 12, 15-THETA 等 10 个潜在标志物水平下降, 给予 QQCP 治疗后, 20 个潜在生物标志物水平均得到了不同程度的回调, 其中亚油酸、白三烯 B4 等 4 个潜在标志物水平与模型组相比显著升高, 焦谷氨酸、5, 6-环氧-8, 11, 14-廿碳三烯酸水平显著降低。3.2.3 潜在生物标志物的生物学意义阐释亚油酸是 1 种功能性的多不饱和脂肪酸, 具有增强机体免疫功能的作用, 主要表现在增加机体非特异
9、性抗体的产生, 提高淋巴细胞的增殖, 增强吞噬细胞的吞噬能力。亚油酸能提高鼠肠淋巴结和脾淋巴细胞分泌 Ig G、Ig A 和 Ig M 的量12, 降低炎性细胞因子的释放, 特别是肿瘤坏死因子- (TNF-) 。本研究结果显示模型组小鼠肺组织中亚油酸水平降低, 提示 MPP 可引起亚油酸量降低, 影响免疫球蛋白的表达, 使免疫力降低, 炎性因子释放增加, 炎症反应扩大。QQCP 组与模型组相比亚油酸水平显著升高, 提示 QQCP 在增强免疫力、减轻炎症反应方面发挥了作用。花生四烯酸是人体必需的游离脂肪酸之一。花生四烯酸可通过环氧化酶途径和脂氧化酶途径分别代谢为前列腺素、血栓素和白三烯 2 种代
10、谢产物。花生四烯酸及其代谢产物在预防呼吸道疾病、调节免疫、抗炎方面发挥着至关重要的作用13。本研究中, 模型组小鼠肺组织中花生四烯酸水平降低, 提示 MPP 可引起花生四烯酸水平下降, 其代谢物白三烯水平升高进而导致支气管平滑肌收缩, 使气道狭窄甚至阻塞。QQCP 治疗后小鼠肺组织中花生四烯酸水平显著升高, 白三烯水平降低, 说明 QQCP 可缓解气管平滑肌收缩, 减少气道狭窄, 从而发挥治疗 MPP 的作用。维生素 A 与视黄醇代谢通路有关, 对维持视觉并促进机体生长发育有重要作用, 还可增强机体的免疫反应, 增加淋巴细胞与肺泡巨噬细胞浸润, 并对肺泡上皮与气道上皮有明显的保护作用14。视黄
11、醇代谢通路紊乱、维生素 A 水平降低会直接影响胸腺上皮细胞角蛋白的形成, 进而影响到免疫细胞的发育, 导致机体免疫功能下降15。另外, 维生素 A 的缺乏会使气管、支气管上皮细胞发育受阻, 细胞脱落, 气道上皮完整性遭到破坏。本研究中, 模型组小鼠肺组织中维生素 A 水平降低, 提示 MPP 可引起维生素 A 水平下降, 进而导致气道上皮完整性破坏和机体免疫功能下降。QQCP 治疗后小鼠肺组织中维生素 A 升高, 说明QQCP 可通过保护气道上皮细胞、提高机体免疫功能发挥治疗 MPP 作用。4 结论本研究采用 UPLC-Q-TOF-MS 技术结合 PCA、PLS-DA 手段, 进行了 QQCP
12、 治疗 MP肺组织代谢组学研究, 分析鉴定了 20 种潜在生物标志物, 其中正离子模式下10 种, 负离子模式下 10 种。这些生物标志物主要涉及 9 条代谢通路, 说明QQCP 通过影响视黄醇、亚油酸、花生四烯酸代谢等各途径发挥治疗作用。从各生物标志物的回归趋势及相关生物功能分析表明, QQCP 具有良好的治疗 MPP 的作用, 能够从整体上纠正代谢轮廓的改变, 体现了 QQCP 治疗 MPP 的多途径、多靶点、整体调节的作用特点。参考文献1Park S J, Pai K S, Kim A R, et al.Fulminant and futal multiple organ failure
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