1、抗多肽制备流程及原理,11/11/8,1. 抗原多肽的设计 2. 抗原多肽的偶联策略 3. 多肽合成简介 4. 抗多肽血清的制备 5. 血清的检测,1. 抗原多肽的设计,为产生有效的抗体，第一步是设计好的抗原，此抗原可以来源于整个蛋白质的一部分：一个或几抗原决定簇区域的序列。（1）什么是抗原决定簇？蛋白质表面部分可以使免疫系统产生抗体的区域叫抗原决定簇。一般抗原决定簇是由 612 氨基酸或碳水基团组成，它可以是由连续序列（蛋白质一 级 结 构 ） 组 成 或 由 不 连 续 的 蛋 白 质 三 维 结 构 组 成 。,（2） 选择抗原决定簇为选择好的抗原决定簇，应符合以下三点： 1亲水性(Hy
2、drophilicity) ：大部分抗原决定簇是亲水性的； 2表面可接触性(Surface Accessibility) ：大部分抗体只与蛋白质表面部分结合； 3有弹性(flexibility) ：许多已知的抗原决定簇是在自由活动区域。所以一般来说蛋白质的 N 端及 C 端是很好的抗原决定簇区域。,（3） 抗原性与免疫原性单独的抗原决定簇是不能产生免疫反应，它只有抗原性但没有免疫原性，为使它能具有免疫原性，它必须偶联在载体蛋白上。（4） 抗原决定簇的预测对每个氨基酸的表面可接触性、亲水性和弹性进行计算可以大体推算出抗原决定簇区域，抗原决定簇区域应综合以上三个特点。目前市面上有几个专业测定软件满
3、足需要：如MacVestor , Protean , GCG 等。,备注,（5）设计多肽序列的长度,抗原性区域确定以后，接下来要确定多肽的长度。关于选定多肽长度有两种不同的观点。一种观点认为长的多肽（2040个氨基酸）比较好，因为长的多肽无疑会增加抗原基的数量。另一种观点则认为小的多肽更有效，使用小的多肽能保障所产生抗体的位点特异性。但有一点是明确的，不管长度如何，所选多肽必须能够较容易地通过生化合成得到，并且能溶解到水溶性缓冲剂进行载体蛋白的耦联。由于受副反应的影响较大，高于二十个氨基酸的多肽通常很难进行高纯度合成，并且常常会含有缺失性序列。,另一方面，太短的多肽（10个氨基酸）则会产生识别
4、特异性很强的抗体，以至于无法识别整体蛋白，或亲和性很低。因此综合考虑制备性抗原地多肽有效长度一般是1020个氨基。这种长度的多肽序列会最大程度的减小生化合成困难，具有一定的水溶性，也会具有一定程度的二级结构。（6） 设计合成多肽一旦抗原序列决定后，接下来就是设计所需合成的多肽了，设计时除了注意其序列外，同时应考虑一些产生免疫机制问题，如：1载体蛋白的接入位置 。,2如果其序列是位于蛋白 C 端的，此多肽 C 端一定是自由的羧基团，而N 端被掩盖。同时如果载体蛋白是通过半胱氨酸偶联，此半胱氨酸应处于 N 端位置，使 C 端完全暴露给免疫系统。3相反，如果其序列是位于蛋白质 N 端，此多肽 C 端
5、应掩盖，暴露出 N端，而载体蛋白应在 C 端。,2. 抗原多肽的耦联策略,化学合成的多肽抗原是小分子，本身很难具有好的抗原性，只能诱导动物产生很弱的免疫反应，因而与载体蛋白耦联是很重要的。载体蛋白含有很多抗原决定基，能够刺激T细胞，进而诱导B细胞反应。用于与多肽耦联的载体蛋白有多种，其中最常用的是(keyhole limpet hemacyanin (KLH), 牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA), 卵清蛋白(ovalbumin，OVA)和牛甲状腺球蛋白(bovine thyroglobulin，THY)。KLH具有更高的抗原性，是最为常用的多肽耦联载体。BSA也
6、常用来作为多肽载体，但由于BSA经常被用做检测试验的阻断剂而使得该方法生产的抗体在应用上存在着一定的局限性。,设计合成性多肽常常被忽略的一个方面是如何将多肽耦联到载体蛋白上。例如，N-端序列需要通过C-端氨基酸耦联，而C-端序列则需要通过N-端氨基酸耦联。内部序列则可以耦联到任何一端。内部序列耦联的另一考量则是将非共轭端酰基化或氨基化，因为原蛋白分子序列中不会含有带电荷的末端。最常用的耦联方法都是基于自由氨基(alph-氨基或Lys)、sufhydryl (Cys)或羧基集团(Asp, Glu, 或 alpha-羧基)的存在。所有的耦联方法都应该是通过羧基或氨基端残基将多肽耦联到载体蛋白上。所
7、选序列不能有多个残基都能参与所选耦联化学反应。如果多个反应位点存在，可以考虑将多肽序列缩短，或者选择所有反应位点都位于一端的多肽。对于内部序列通常会使用离所预测抗原位点较远的一端进行耦联，这样可以避免可能的屏蔽问题。,除非研究人员另做说明，我们通常使用EDC (1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride)或carbodiimide 方法将多肽和载体进行耦联。Carbodiimides能激活天冬酰胺酸及谷氨酸的侧链羧基集团及末端羧基集团，使之与主胺基发生耦联反应。激活的多肽与载体蛋白混合而产生最终的共轭体。如果载体蛋白
8、先被激活，EDC方法则通过N-末端alpha-氨基，或者，如果序列中有赖氨酸的话，则可以通过赖氨酸的侧链氨基与载体蛋白耦联。m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide 酯(MBS)是一种双性多肽耦联试剂，可以将多肽与载体蛋白通过半胱氨酸耦联。耦联发生在半胱氨酸的硫醇基。,如果多肽序列中不包括半胱氨酸，可以将一个半胱氨酸加到多肽的N-端或C-端，以获得可控性更强的多肽与载体蛋白的耦联。为了合成方便，我们建议将半胱氨酸加到多肽的N-末端。戊二醛是一种双作用耦联试剂，可以将两个化合物通过氨基集团耦联在一起。戊二醛能起到非常灵活的间隔多肽和载体蛋白的作用，时多肽能尽
9、可能的暴露给免疫系统。但是，戊二醛是一种反应性很强的化合物，可以和Cys, Tyr及His等氨基酸发生一定程度的反应。反应后会形成结构很难预测的共轭体。因此，如果多肽序列末端只含有一个单一的自由氨基时，戊二醛方法非常有用。如果多肽含有多个自由氨基集团，会形成多聚合物，结构很难预测，尽管有很高的抗原性。,因为与牛血清白蛋白（BSA）耦联的多肽刺激产生的抗血清也含有针对BSA的抗体，一次可能导致假阳性结果。尽管KLH较大并有抗原性，但它在耦联过程中可能会沉淀，因而有时候会很难处理。卵清蛋白（OVA）是另一种可以使用的载体蛋白。当要检验抗体只是针对多肽而不是针对载体蛋白时，OVA时用作第二载体的很好
10、选择。当要将抗体抗载体蛋白的反应降到最低时，可以使用兔血清白蛋白做载体。,用RSA耦联体免疫过的兔子不太可能产生针对载体的抗体，因为RSA是兔子自身的蛋白。如果注射动物不是兔子RSA则不会被认为是自体蛋白。免疫系统是对多肽载体蛋白整体发生反应的，即免疫反应有一部分是针对耦联多肽，一部分是针对中间连接体，有一部分是针对载体蛋白。当用ELISA做筛选时建议使用不同载体蛋白耦联的多肽聚合物。如果ELISA是在非耦联多肽涂层的多孔板上做时则没有必要这样做。,3. 多肽合成原理,3.1多肽简介肽键是蛋白质分子中氨基酸间的主要连接方式，是一个alpha-NH2和一个alpha-COOH脱水缩合而成的酰胺键
11、。一个氨基酸的-羧基与另一个氨基酸的-氨基之间失去一分子水相互连接而成的化合物称为肽(peptide),由2 个氨基酸缩合形成的肽叫二肽，由3 个氨基酸缩合形成的肽叫三肽，少于10 个氨基酸的肽称为寡肽，由10个以上氨基酸形成的肽叫多肽，因此蛋白质的结构就是多肽链结构。每个肽在其一端有一自由氨基，称为氨基端或N-末端，在另一端有一自由羧基，称为羧基端或C-末端。,3.2 多肽合成原理,化学合成多肽就把氨基酸按照一定的氨基酸排列顺序和连接方式连接起来。为了得到具有特定氨基酸顺序的合成多肽，采用逐步缩合的定向合成方法，即先将不需要反应的氨基或羧基用适当的基团保护起来，再进行连接反应，以保证反应的定
12、向进行。,对于长肽合成，一般有逐步增长和片段缩合两种方式，前者由起始氨基酸（或肽）开始，每连接一次增长一个氨基酸，后者由C保护肽同N保护肽缩合来得到两者长度相加的新肽链。,3.3 氨基保护,氨基保护常用的保护基分为烷氧羰基、酰基，和烷基三大类。因为N烷氧羰基的保护的氨基酸在接肽时不易发生消旋化，故烷氧羰基使用最多。,3.4 羧基保护,目前使用的羧基保护大致可以分为三种 一种可以用碱皂化脱去，如甲酯、乙酯 另一种可以用酸脱去，如叔丁酯、对甲氧苄酯，邻苯二甲酰亚胺甲酯等 第三种除了用酸或碱脱去外，还可以用其他的方法选择性脱去，如苄酯、苯羰基甲酯、三甲硅乙酯,3.5侧链功能团的保护,由于不少氨基酸的
13、侧链都带有能反应的基团，如羟基、巯基、酚基、B-和r-羧基、胍基、咪唑基、吲哚基和硫醚基等，为了避免副反应的发生，在多肽合成中往往也选用适当的保护基将它们保护起来,3.6 肽键生成的方法,形成肽键的方法基本可以分为四类：一是羧基活化法；二是氨基活化法；三是四组份合成法；四是利用蛋白水解酶的逆反应，亦称酶促合成法。羧基活化法的基本原理是先将N-保护氨基酸或肽的a-羧基转变成活化型的RCOX，从而有利于NH2R对它进行亲核反应生成RCONHR。一般来说，取代基团X的吸电子性越强，其对羧基的活化能力也越强。,羧基取代基的活化能力顺序,3.7 肽键生成的方法,羧基活化法有碳二亚胺法、混合酸酐法、活化酯
14、法、NCA法等 1.碳二亚胺法,2、混合酸酐法:反应一般分两部进行,副反应：,歧化反应和酸酐分解：,二酰胺的形成：,羧酸酯氨解生成酰胺的反应是胺对酯进行亲核取代，因此增加R基团的吸电子能力必将增加羰基碳原子的正电性而有利于氨解反应的进行。,3、活化酯法,活化酯的种类：1）芳基活化酯2）烯基酯3）与N-羟基化合物形成的活化酯4）活化酰胺5）固相活化酯 活化酯的制备：1）DCC法2）转酯反应3）加成4）混合酸酐法,4、NCA法,优点：1）反应速度快，肽合成周期短 2）得到的氨基游离的肽可直接用于第2轮的肽合成 3）侧链可以较少的保护，除NCA的侧链需保护外，氨基组分只有Lys和Cys必须保护 4）
15、反应有可能在水溶液中进行。,3.8 固相合成,固相合成的主要设计思想是：先将所要合成肽链的末端氨基酸的羧基以共价键的结构同一个不溶性的高分子树脂相连，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组分反应接长肽链。这样的步骤可以重复的多次进行下去，即缩合洗涤去保护中和和洗涤下一轮缩合，最后达到所需要合成的肽链长度。,固相合成流程示意：,氨基酸在进入目的肽之前，氨基端需要保护基。根据保护基的不同，多肽固相合成方法可以分为两大类：Boc方法和Fmoc方法。,4. 抗多肽血清的制备,4.1 动物选择 要生成好的抗体，必须选择与抗原源差异较大的动物。要想获得最大的免疫
16、反应，绝对不能让免疫动物对抗原产生自体识别。例如，要想生成抗人体蛋白的抗体，使用兔或老鼠比使用猴子要好。对于非常保守的哺乳动物蛋白，使用鸟类动物（如鸡）效果较好。,4.2 动物免疫,我们通常使用弗氏佐剂（Freunds）与抗原进行混合。第一次注射完全使用Freunds的免疫辅助剂。辅助剂与抗原联合使用，可以提高免疫反应，从而用较少的疫苗可以产生较强的免疫反应。佐剂可以使抗原缓慢释放，从而产生持续性刺激。注射方式为多位点的皮下注射。每只注射动物都要先收集免疫前血样，以用于和以后的免疫血样比较。所采集的血清样本含有不同的免疫型和亚型。,备注,4.3 抗多肽血清的制备（SOP）,一、材料(带项目见附
17、录1)1、家兔：健康雄性家兔。至少准备2只家兔，以防一只家兔死亡或者免疫接种失败。2、肽一载体：上海强耀生物，规格2.5mg肽/瓶。3、PBS，(0.01mo1/L、 pH7.4)4、弗氏完全佐剂（FCA）(sigma)5、弗氏不完全佐剂（FICA）(sigma)6、免疫抗原的制备取2.5mg肽- KLH溶解到2.5ml的PBS中，然后加入等体积的弗氏完全佐剂混合乳化（采用双头抽吸装置乳化）。每只家兔接种混合物2.5mL。如果是用弗氏不完全佐剂时，将上述“弗氏完全佐剂”替换为“弗氏不完全佐剂”。,二、试验操作程序 1、免疫程序的确定,2、操作步骤,（1）收集血样(如从耳动脉或耳静脉)，每只家兔
18、准备25ml免疫前的血清。（由于本实验室已经储备家兔免疫前血清，本步骤可以省略）。（2）按表1中免疫程序进行免疫。a）将0.71.0mg的肽一载体的连接体溶于1ml的PBS，并加入1ml FCA彻底混溶。每只家兔免疫接种1ml这种稳定的乳浊液，在皮下多个位点接种，每个位点0.1 0.2ml。b) 26周后(或检测到免疫反应减弱时较理想；准备一份新的乳浊制剂追加剂量，使用相同的连接体但添加的是弗氏不完全佐剂。如上所述在皮下多个位点接种。若免疫原的量有限，则使用初次免疫接种量的1/4。注意加强免疫时注意家兔皮肤溃疡情况，如有，减少皮下注射、以肌肉注射为主。,c）在加强免疫后3-4周, 再次加强免疫
19、一次。注意：不要第三次加强免疫。(3)最后一次接种后34周后再次取血。采血前1-2天，停料、保证充分饮水。(4)血清的析出和保存新鲜采集的血液在室温或37静置0.5-1h，使其自然凝固。用细长拨针沿管壁轻轻地绕一周，使血凝块同管壁分离。4过夜、使血凝块收缩。小心吸出血清，不要吸到血凝块。对剩余或析出血清量少的可以在4、10 000离心10min，但注意单独分装。制备血清时的溶血会影响血清质量，出现假阳性。,溶血原因：（1）术部消毒酒精不干，注射器、术者、析血清用塑料或玻璃管潮湿；（2）采血是真空度过大、抽血速度过快；（3）从采血针管内将血液注入析血清用塑料或玻璃管时，没有去针头或速度过快。(5
20、)血清保存如要防腐加叠氮化钠使终浓度为0.02%。血清一般在冻存前分装成100-500L, -20可存放数年。解冻可在不高于室温（25）或4下进行，并存于4，工作液4可存放数月。注意：4存放时可能产生不溶性脂类，似微生物污染，可10 000g离心除去。如离心后在上层可以将液相吸出。(6)血清中抗体效价测定可选：通过免疫亲和层析法，将抗血清中不需要的成分(如抗载体的抗体)去掉以纯化抗肽的抗体。,4.5 抗体鉴定 检测抗多肽反应是否发生的最简单方法就是抗多肽ELISA。有两种技术可以将多肽链接到ELISA板上。第一种方法就是直接将多肽链接到盘上。但如果链接氨基酸恰好是抗原决定簇的一部分，则抗体无法
21、和多肽进一步链接，这样产生假阴性结果的可能性增加。第二种方法则是先将多肽与载体蛋白耦合，然后将多肽蛋白耦合体链接到ELISA盘上。这种链接方法会使抗体多肽的结合成功率提高，因为多肽不是直接嵌入盘膜，因而会更加暴露给抗体。这种方法因而更可靠，可重复性更高。需要注意的是，用于该方法的载体蛋白必须不同于用于免疫耦合的载体蛋白。这样会避免血清中抗载体蛋白反应所导致的高背景反应。,当做血清检测时，另一点需要记住的是，由于免疫多肽与自然多肽结构上的差别，检测时的抗多肽反应与试剂的抗多肽反应可能是不同的。任何检测，尤其是测定滴定量以决定收获点时，必须包括针对天然状态下蛋白的检测。当然可以做针对天然状态下蛋白
22、的ELISA；但由于血清在不同检测体系中表现会不一样，因此最好在血清被日常使用的体系中进行蛋白识别鉴定。如果血清将用于免疫沉淀反应，就应该进行针对该反应的检测。,返回,抗原性抗原能与其所诱导产生的免疫效应物质(抗体或致敏淋巴细胞)发生特异性结合的特性。 免疫原性抗原(表位)作用于T淋巴细胞、B淋巴细胞的抗原识别受体(T细胞受体、B细胞受体)，促使其增殖、分化，并产生免疫效应物质(特异性抗体和致敏淋巴细胞)的特性。,返回,弗氏不完全佐剂 弗氏完全佐剂是一种油包水的乳浊液，含结核分枝杆菌的细胞壁成分。佐剂活性来自于油滴中免疫原的持续释放，并刺激局部免疫反应。弗氏不完全佐剂 弗氏不完全佐剂用于初次免疫刺激。为了减少副作用，不含结核分枝杆菌成分的弗氏不完全佐剂用于加强免疫。,
