1、猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂 4848 的鉴定及表达 梁盼红 刘光学 毛立 张少华 王莉杰 王立群 骆学农 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室甘肃省动物寄生虫病重点实验室 摘 要： 为鉴定并表达猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂 (TsSerpin) , 提取猪囊尾蚴总RNA, 设计引物并通过 RT-PCR 技术扩增 TsSerpin4848 基因, 将纯化的 PCR 产物连接到 p MD19-T 载体后转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞, 筛选阳性克隆并测序, 并用生物信息学方法分析其序列和结构特征。构建 p ET-30a (+) -4848 重组表达载体, 经酶切鉴定及测序验
2、证后转入大肠杆菌 BL21 (DE3) 中进行诱导表达, 目的蛋白纯化后进行 SDSPAGE 和 Western-blot 分析。结果表明, TsSerpin4848的开放阅读框由 1 065 个核苷酸组成, 编码 355 个氨基酸残基, 其理论分子质量约为 39 ku。TsSerpin4848 含有 serpin 家族保守序列 DEEGAE 和FIVDHPFLFFI, 并含有 serpin 特有的反应中心环结构域, 其三级结构中有 8 个 螺旋和 3 个 折叠;重组 TsSerpin4848 蛋白在大肠杆菌中主要以包涵体形式存在, 可被猪囊尾蚴阳性血清识别, 表明 TsSerpin4848
3、蛋白具有良好的反应原性, 有望作为猪囊虫病诊断的候选抗原。关键词： 猪带绦虫; 丝氨酸蛋白酶抑制剂; 鉴定; 表达; 候选抗原; 作者简介：梁盼红 (1991-) , 女, 甘肃兰州人, 硕士生, 研究方向为寄生虫分子生物学与免疫学。作者简介：骆学农, 研究员, 博士生导师, 主要从事人兽共患病与兽医公共卫生研究, Tel:0931-8342716, E-mail:收稿日期：2017-06-06基金：国家重点研发计划项目 (2017YFD0501303) Identification and expression of Taenia solium serine protease inhibit
4、or 4848LIANG Pan-hong LIU Guang-xue MAO Li ZHANG Shao-hua WANG Li-jie WANG Li-qun LUO Xue-nong Key Laboratory of Veterinary Parasitology of Gansu Province/State Key Laboratory of Veterinary Etiological Biology/Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences; Abstract：
5、 To identify and express the serine protease inhibitor of Taenia solium (TsSerpin) , the total RNA was extracted from T.solium metacestodes.Specific primers were designed and used to amplify TsSerpin4848 by RT-PCR.PCR products were ligated into the p MD19-T vector.After being transformed into Escher
6、ichia coli DH5, the positive clones were identified and confirmed by sequencing.The sequence of TsSerpin4848 was analyzed with the bioinformatics software.The recombinant p ET-30 a (+) -4848 plasmid was constructed and transformed into E.coli BL21 (DE3) .The target protein was expressed, purified an
7、d analyzed by SDS-PAGE and Western-blot.In result, TsSerpin4848 c DNA sequence contained an open reading frame of 1 065 nucleotides, and the deduced protein consisted of 355 amino acids with the theoretical protein molecular weight of 39 ku.TsSerpin4848 had a serpin conserved structure domain with t
8、he DEEGAE and FIVDHPFLFFI, and a specific reactive centre loop (RCL) motif.Analysis of tertiary structure of TsSerpin-4848 revealed that it had eight -helices and three -sheets.The expressed products of TsSerpin4848, existed in inclusion bodies, could be recognized by the positive serum from the pig
9、 infected with T.solium by immunoblotting, indicating that the protein TsSerpin4848 has a good immunogenicity and it is hopeful to be a diagnostic antigen for cysticercosis.Keyword： Taenia solium; serine protease inhibitor; identification; expression; candidate antigen; Received： 2017-06-06猪囊虫是猪带绦虫
10、(Taenia solium) 的幼虫, 主要寄生于猪或人的肌肉及脑组织, 可引起人畜共患的猪囊虫病 (cysticercosis) 。猪囊虫病呈世界性分布, 但主要流行于亚洲、非洲和拉丁美洲。我国每年因猪囊虫感染而废弃的猪肉所造成的经济损失高达 1.21 亿美元1。因此, 猪囊虫病不仅对畜牧业造成较大的经济损失, 也严重威胁着人体健康及公共卫生安全2。目前研究表明, 寄生性蠕虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serine protease inhibitor, 简称 Serpin) 可通过抑制宿主丝氨酸蛋白水解酶的活性, 从而使寄生性蠕虫免受宿主蛋白水解酶的降解, 逃避宿主的防御机制, 有利于寄生性
11、蠕虫的入侵、存活及在宿主体内的定植3。因此, Serpin 在宿主与寄生性蠕虫的相互作用中起重要作用。Serpin 是丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族中的一类, 由 40 多个来源不同的成员组成, 其中大多数的成员都是单链糖蛋白, 分子质量为 40100 ku。Serpin 广泛存在于寄生性蠕虫、高等动物、昆虫以及植物和病毒中4-6, 参与许多基本的生理学反应, 如血液凝固、 (血) 纤维蛋白溶解、炎症、补体激活、信号级联放大、免疫应答和肿瘤抑制等7-9。目前研究显示, 线虫、吸虫和绦虫均有 Serpin 存在, 而且大多可分泌到虫体外, 易被宿主的免疫系统识别, 从而引起宿主的免疫应答。Ghendl
12、er 等10从曼氏血吸虫成虫中鉴定了丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 Smpi56, 其编码蛋白可抑制弹性蛋白酶的活性。L-im 等11发现, Serpin 可使感染血吸虫的小鼠获得 80%的减虫率和 92%的减卵率。Merckelbach 等12发现, 原核表达的多房棘球蚴Serpin 能抑制胰蛋白酶、糜蛋白酶及弹性蛋白酶的活性, 推测多房棘球绦虫能抵抗宿主肠道消化酶对虫体的损伤, 以此逃避宿主的免疫攻击。因此, 笔者推测 Ts Serpin 也具有与棘球蚴 Serpin 类似的功能, 有望成为重要药物靶标或有潜力的疫苗与诊断候选抗原, 用于猪带绦虫和囊尾蚴病的综合防控。本研究拟对猪带绦虫丝氨酸蛋白酶
13、家族成员之一的 Ts Serpin4848 进行克隆、序列特征分析和蛋白表达, 探索其作为猪囊虫病诊断抗原的可行性, 为研制猪囊虫病新型诊断技术奠定基础。1 材料与方法1.1 虫体、血清与试剂猪囊尾蚴、猪囊尾蚴阳性血清与阴性血清均由中国农业科学院兰州兽医研究所蠕虫病课题组保存。TRIzol 试剂、反转录试剂盒 (Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit) 、质粒提取试剂盒、DNA 胶回收试剂盒、p MD19-T 载体、限制性内切酶 Bam H和 Hind、T4 DNA 连接酶均购自宝生物工程 (大连) 有限公司。Prestained Protein
14、 Ladder 购自美国 Thermo 公司。p ET-30a (+) 、大肠杆菌 DH5 和 BL21 (DE3) 感受态细胞、异丙基-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 、X-gal、5蛋白上样缓冲液均购自北京全式金生物技术有限公司。辣根过氧化物酶标记的家兔抗猪 Ig G (HRP-Ig G) 购自美国 Sigma 公司。Ni Seph arose 6 Fast Flow 蛋白纯化试剂盒购自美国 GE 公司。1.2 目的基因的克隆和生物信息学分析从猪带绦虫基因组数据库 (http:/192.168.51.199) 中搜索 Serpin 同源基因, 将其中之一命名为 TsSerpin4848。根
15、据 Ts Serpin4848 的核苷酸序列, 利用Primer Premier 5.0 软件设计其特异性引物 (Ts Serpin4848-F:5-CGCGGA TC CA TGTC CC CA CTGA GC-ATA-3, 下划线处为 Bam H酶切位点;TsSerpin4848-R:5-CCCAAGCTTGGTACTTGCTTTC CGG-TTC-3, 下划线处为Hind酶切位点) 。用 TRIzol 抽提猪囊尾蚴总 RNA, 利用 Revert Aid First Strand c DNA Synthesis Kit 提供的 Oligo (d T) 和反转录酶 (Prime Scrip
16、tRTase) 合成 c DNA 第一链, 进而用 Ts Serpin4848 的特异性引物进行PCR 扩增。纯化的 PCR 产物与 p MD19-T 载体连接, 转化大肠杆菌 DH5 感受态细胞。将经菌液 PCR 鉴定为阳性的克隆送江苏金唯智生物技术有限公司测序验证。应用在线软件 Prot Param (http:/web.expasy.org/prot param/) 预测蛋白质的理论分子质量、理论等电点、氨基酸组成等。利用在线软件 Prot Scale (http:/web.expasy.org/protscale/) 及 Hphob./Kyte利用镍 NTA 琼脂糖凝胶对目的蛋白进行纯
17、化, 然后进行 SDS-PAGE, 用半干法将蛋白从凝胶电转至硝酸纤维素膜, 用 50 g/L 脱脂奶粉溶液 37封闭 1 h, PBST 充分洗涤后, 分别用 PBST 1200 稀释的猪囊尾蚴阳性血清和辣根过氧化物酶标记的家兔抗猪 Ig G (110 000 稀释) 于 37摇床孵育 1 h;DAB 避光显色 23 min, 待出现阳性条带后, 用自来水冲洗终止反应。2 结果2.1 Ts Serpin4848 的序列特征RT-PCR 扩增结果 (见图 1) 显示, 目的产物的大小约 1 000 bp。阳性克隆测序表明 Ts Serpin4848 的开放阅读框由 1065 个核苷酸组成, 编
18、码 355 个氨基酸残基, 理论分子质量为 39 ku。生物信息学预测分析表明, Ts Serpin4848 的 N 末端无信号肽, 属于非跨膜蛋白, 其氨基酸序列无潜在的糖基化位点, 但有 18 个丝氨酸磷酸化位点、7 个苏氨酸磷酸化位点和 2 个酪氨酸磷酸化位点。同源序列比较发现, Ts Serpin4848 拥有 Serpins 家族共有的活性位点即反应中心环 (RCL) 和特征性保守结构域:DEEGAE 和 FIVDHPF-LFFI (见图 2) 。利用 MEGA 6.0 软件中的 Test Maximum Likelihood Tree 方法构建的系统进化树 (见图 3) 表明, T
19、s Serpin4848 与多房棘球绦虫的 Serpin 位于同一分支, 亲缘关系最近, 而与其他物种的亲缘关系较远。以 Serpin B3 为参考模板 (登录号 2zv6.2) , Predict Protein 预测表明, Ts Serpin4848 蛋白的三级结构中有 8 个 螺旋, 3 个 折叠, 其余部分为无规卷曲 (见图 4) , 这些均符合 Serpin 家族的结构特征。以上分析充分表明, Ts Serpin4848 是猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂。图 1 Ts Serpin4848 基因的 PCR 扩增 Fig.1 PCR amplification of Ts Serpin48
20、48 gene 下载原图M:DNA 分子质量标准;1:Ts Serpin 4848 基因的扩增产物 M:DL2000 DNA Marker;1:PCR-amplified Ts Serpin4848 gene2.2 重组表达载体 p ET-30a (+) -4848 的构建重组质粒 p ET-30a (+) -4848 经 PCR 鉴定和酶切鉴定均得到约 1 065 bp 大小的片段 (见图 5) , 说明目的片段已插入表达载体。2.3 目的产物的表达与分析SDS-PAGE 结果 (见图 6) 显示, 在 45 ku 处出现单一的目的条带, 说明目的蛋白纯化效果较好。Western-blot
21、分析结果 (见图 7) 表明, 目的蛋白可与猪囊尾蚴阳性血清发生特异性反应, 而与阴性血清不反应, 说明 Ts Serpin4848 能被猪囊尾蚴阳性血清所识别, 具有良好的反应原性。3 讨论Serpin 是一类结构相似、功能多样的球状蛋白酶抑制剂超家族, 核心结构含有89 个 -螺旋, 3 个 -折叠组成的三级结构13, 主要标志性结构是其保守的反应中心环 (reactive centre loop, RCL) 。RCL 结构通常由 20 个氨基酸组成, 该区域可结合其相应靶蛋白的活性位点14, 使 Serpin 的构象发生变化, 从而使相应蛋白激酶的构象发生改变, 发挥其抑制作用15。本研
22、究通过生物信息学软件对 Ts Serpin-4848 蛋白进行预测分析, 发现该蛋白 N 端无信号肽序列, 说明该蛋白可能为非分泌型蛋白, 但其具有丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族成员的保守结构域 DEEGAE 和 FIVDHPFLFI 及 RCL 结构域。同时, 运用 Clustal W软件对猪带绦虫、多房棘球绦虫、日本血吸虫、曼氏血吸虫、卫氏并殖吸虫、捻转血矛线虫、马来丝虫等不同物种的 Serpin 进行了序列比对, 发现 Ts Serpin4848 在 RCL 区域与其他物种具有很高的序列一致性。运用 MEGA 6.0 软件对其进行进化分析表明, Ts Serpin4848 与多房棘球绦虫 Se
23、rpin 的亲缘关系较近, 说明二者可能作用于相同的丝氨酸蛋白酶, 即抑制宿主胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性, 有利于虫体在宿主肠道内的寄生。上述分析结果充分表明, 笔者已经成功获得猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因 Ts Serpin4848。目前, 尽管在许多寄生性蠕虫中已鉴定了丝氨酸蛋白酶抑制剂, 而且猪带绦虫丝氨酸蛋白酶抑制剂 (Serpin) B6 的鉴定也已有报道, 但对猪带绦虫 Serpin 的功能研究尚属空白。所以, 本研究将为进一步阐明猪带绦虫 Serpin 的靶标蛋白及其功能具有重要意义。图 2 Ts Serpin4848 部分序列与其他寄生虫丝氨酸蛋白酶抑制剂的序列比对Fig.2
24、Alignment of partial sequence of Ts Serpin4848 and serine protease inhibitors from other parasites 下载原图红色下划线表示 serpins 特征性保守区序列;黑色方框表示 serpins 较为保守的反应中心环。Bm:马来丝虫;Sj:日本血吸虫;Sh:埃及血吸虫;Tv:透明毛线虫;Hc:捻转血毛线虫;Ts:猪带绦虫;Em:多房棘球蚴;Pw:卫氏并殖吸虫;Sm:曼氏血吸虫Serpin conserved structure domains of Ts Serpin4848 are in red und
25、erline;the more conservative reactive cent re loops of serpin are in black box.Bm:Brugia malayi;Sj:Schistosoma japonicum;Sh:Schistosoma haematobium;Tv:Trichostrongylus vitrinus;Hc:Haemonchus contortus;Ts:Taenia solium;Em:Echinococcus multilocularis;Pw:Paragonimus westermani;Sm:Schistosoma mansoni图 3
26、 不同物种 Serpins 的系统进化分析 Fig.3 Phylogenetic analysis of Serpins from different species 下载原图Sm:曼氏血吸虫 Schistosoma mansoni;Sj:日本血吸虫 Schistosoma japonicum;Pw:卫氏并殖吸虫 Paragonimus westermani;Cs:中华枝睾吸虫Clonorchis s inensis;Ts:猪带绦虫 Taenia solium;Em:多房棘球蚴Echinococcus multilocularis;Bm:马来丝虫 Brugia malayi;Tv:透明毛线虫T
27、richostrongylus vitrinus;Hc:捻转血毛线虫 Haemonchus contortus;Sh:埃及血吸虫 Schistosoma haematobium图 5 p ET-30a (+) -4848 的酶切鉴定 Fig.5 Identification of p ET-30a (+) -4848 by restriction en-zyme digestion 下载原图M:DNA 分子质量标准;1:质粒 p ET-30a (+) -4848;2:p ET-30a (+) -4848 的酶切产物 M:DL15000 DNA Marker;1:p ET-30a (+) -48
28、48 plasmid;2:The product of enzyme digestion for p ET-30a (+) -4848图 4 Ts Serpin4848 三级结构的预测 Fig.4 Prediction of the 3D structure of Ts Serpin4848 下载原图a: 螺旋;b: 折叠;c:反应中心环 a:-helix;b:-sheet;c:Reactive centre loop图 6 Ts Serpin4848 的纯化 Fig.6 Purification for Ts Serpin4848 下载原图M:蛋白质分子质量标准;1:50 mmol/L 咪唑
29、溶液;2:100 mmol/L 咪唑溶液;3:200 mmol/L 咪唑溶液;4:300 mmol/L 咪唑溶液 M:Protein molecular weight Marker;1:50 mmol/L Imidazole solution;2:100 mmol/L Imidazole solution;3:200 mmol/L Imidazole solution;4:300 mmol/L Imidazole solution图 7 Ts Serpin4848 的 Western-blot 分析 Fig.7 Western-blot analysis of Ts Serpin4848 下载
30、原图M:蛋白质分子质量标准;1:猪囊尾蚴阳性血清;2:猪囊尾蚴阴性血清 M:Protein molecular weight Marker;1:Pig positive serum against cysticercosis;2:Pig negative serum本研究通过对大肠杆菌表达的重组 Ts Serpin4848 蛋白进行 Western-blot 分析, 发现 Ts Serpin-4848 能被猪囊尾蚴阳性血清特异性识别, 具有良好的反应原性, 有望作为猪囊尾蚴病血清学诊断的候选抗原。Nagano 等16用旋毛虫感染后第60 天的小鼠血清筛选旋毛虫肌幼虫 c DNA 文库, 鉴定出
31、旋毛虫的丝氨酸蛋白酶抑制剂。吴秀萍等17对克隆的旋毛虫 Ts Serpin 基因进行了表达, 证明重组Ts Serpin 蛋白与旋毛虫感染后第 60 天的猪血清反应, 但与感染后第 26 天的猪血清几乎不反应。盖文燕等18对旋毛虫 Ts Serpin 进行了研究, 结果显示旋毛虫的重组 Serpin 蛋白具有良好的反应原性。本实验室的前期研究已表明, 猪带绦虫 Serpin B6 与 Ts Serpin4848 一样, 也能与猪囊尾蚴阳性血清反应, 但是否与猪细颈囊尾蚴、旋毛虫等阳性血清发生交叉反应, 能否作为猪囊尾蚴病诊断的特异性候选抗原, 尚需进一步的研究。尽管如此, 本研究将为进一步了解
32、寄生虫 Serpin 的结构特征和分子进化关系, 阐明绦虫 Serpin 家族不同成员之间作用的靶蛋白及其功能差异, 研制基于 Ts Serpin 的生物药物奠定基础。参考文献1AKIRA I, CARLO U, QIU J M, et al.Control of echinococcosis and cysticercosis:a public health challenge to international cooperation in ChinaJ.Acta Trop, 2003, 86 (1) :3-17. 2CORAL-ALMEIDA M, GABRIEL S, ABATIH E
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