1、第八讲 植物营养研究的现代技术概况植物营养研究的传统方法 生物模拟 化学分析 核素技术 数理统计传统研究方法难以解决的问题举例细胞水平养分互作机制 -磷 -锌、硅 -盐、钙 -重金属养分的非维管束吸收机理 -荚果、果实养分的确切功能及与细胞结构的关系细胞区隔化与酶促反应定位及与养分转化关系控制植物营养性状基因的克隆、表达与转基因细胞生物学运用近代物理、化学技术和分子生物学概念，研究生命尤其是细胞活动的科学。大大深化对生命本质的认识可供借鉴的细胞和生物学方法 亚细胞组分分级分离技术 电子显微镜技术 电子探针分析技术 显微放射自显影技术 跨膜电位测定技术 细胞化学成分测定技术 抑制剂的选择 分子筛
2、技术 细胞培养技术 基因工程技术1 亚细胞组分分级分离技术 亚细胞水平植物养分吸收和运转机理研究的必要前提 采用机械或化学方法破坏细胞，使之在稀释剂中形成匀浆 根据细胞组分大小和沉降特性进行离心获得目标细胞组分 借助有关手段对目标细胞组分研究2 电子显微镜技术 透射电镜主要用于超薄切片中亚细胞水平内部结构及养分状况观察 扫描电镜适于组织、细胞的外部形态及表面细微结构的研究 二者均可与电子探针配合使用 原子粒显微镜3 电子探针分析技术利用高能电子束轰击试样表面的微小区域得到的特征信号，通过检测发射出的X射线波长 (或能量 )和强度，确定该微区内所含元素的种类和含量可定性检测的元素种类为 5B至
3、92U，可定量分析原子序数在 Na以后的元素电子探针分析表明，缺硫导致油菜叶片、花粉和柱头细胞硫分布显著降低。正常（ A,C）与 缺 硫（ B,D） 油 菜 叶 片、花 粉 和 柱头 细 胞 的 电子 探 针 能 谱图电子探针在分析作物叶片细胞（微区）中元素的含量电子探针微区扫描技术可以很好的将叶肉细胞内元素种类和元素含量测定出来。快速、有效！利用扫描电镜观察， EDAX-9100能谱仪作为电子探针对叶肉细胞中元素含量进行分析，其分析元素范围为 5B 92U，检测极限为 0.1%电子探针在分析作物叶片细胞（微区）中元素的含量4 显微放射自显影 -液体闪烁测定利用放射性同位素产生的射线，使照相乳
4、胶卤化银晶体感光，经显影把感光的卤化银还原成黑银粒。这些感光银粒的存在部位和黑度指示出示踪物存在的部位与数量。常用的同位素有 3H、 14C、32P、 35S、 45Ca、 65Zn等。 应用液体闪烁技术可对亚细胞组分示踪物含量作定量精确测定。采用 45Ca显微放射自显影等研究，提出了花生荚果钙的 Ca2+是通过主动吸收由胞外进入胞质中，并以共质体途径在组织及细胞间运输。5 跨膜电位测定技术 利用专一性微电极测定植物细胞液泡内部和外部溶液的电位差，并与能斯特方程计算结果比较，判断该养分跨膜运动是否为一主动过程。 通常在显微镜下在显微操作台上将玻璃电极插到液泡中测量。显微吸收光度术 细胞不同化学
5、成份染色具有不同的吸收波长，且吸收值与细胞化学含量间存在化学剂量关系，适用于养分胁迫下植物碳氮代射特点的研究，其可测定的物质有蛋白质、核酸、精氨酸、多糖和糖元等6 细胞化学成分测定技术显微荧光探针术 利用特定荧光指示剂对细胞特定组分 (Ca2+、核酸和蛋白质等 )的高度特异亲和力和高荧光量子效率，通过测定荧光强度或荧光激发光谱偏移或发射光谱偏移，确定组分浓度。可连续准确测定细胞内核酸、蛋白质及 Ca2+浓度，而且能直观地提供钙在细胞内分布及流动等重要代谢信息。低效 B高效 B 低效 B高效 B电泳技术 由于某种酶各同工酶之间氨基酸序列不同，胁迫条件下 mRNA表达量不同，在一定 pH的缓冲液中
6、所携带的电荷、荷质及分子形状也不同。电泳时，各同工酶和 mRNA电泳速率差异使之可以彼此分开。该方法对于植物营养遗传特性和分子生理研究有重要意义。7 抑制剂的选择 核酸与蛋白质合成抑制剂 膜功能抑制剂 线粒体和叶绿体功能抑制剂 其他过程抑制剂如钙离子运输等8 分子筛技术 (凝胶过滤技术 ) 在一定凝胶介质（孔径）中，不同分子量大小的物质流速不一样，根据不同时间的流出组分即可把不同分子量大小的物质分离开9 细胞培养技术 在无菌条件下将植物细胞从机体分离出来，在模拟体内环境条件下，让其生存和生长，该技术是植物营养遗传的细胞学工程的基础。它包括愈伤组织培养、单细胞培养及多细胞悬浮培养等10 基因工程
7、技术 （分子操作） 属分子生物学范畴，均为细胞生物学方法，是植物营养遗传特性改良的希望之路。 包括选择目的基因；在细胞体外将载体 (细菌质粒 )与目的基因结合成重组 DNA分子；将重组 DNA分子引入受体细胞，使外源基因得以表达。原位动态测定Nuclear Magnetic Resonance (NMR) CT核磁共振分析技术是利用物理原理，通过对核磁共振谱线特征参数的测定来分析物质的分子结构与性质它不破坏被测样品的内部结构，是一种无损检测方法在化学、生命科学中有广泛的应用。核磁共振技术及其应用11 Electrophysiological techniques123456 7Experime
8、ntal arrangement for leaf cell measurementsNitrate (mM)05101520i (nA )-180-120-600-100 mV-140 mV-180 mVBAVm(mV)-200 -160 -120 -80 -40i (nA )-180-120-6001 mM5 mM7 mM15 mM20 mMICP-MSLA- ICP-MSGC-MSHPLC-MS-By combining the capabilities of advanced samplepreparation methodologies with the latest generat
9、ion ofsecondary ion mass spectrometry instrumentation, we showthat chemical information on the distribution of even dilutespecies in biological samples can be obtained with spatialresolutions of better than 100 nm. Here, we show thedistribution of nickel and other elements in leaf tissue of thenicke
10、l hyperaccumulator plant Alyssum lesbiacum prepared byhigh-pressure freezing and freeze substitution.Reectance optical micrographs of a resin-embedded cross section of nickel-rich Alyssum lesbiacum leaf prepared by high-pressure freezing, followed by freeze substitution, showing a high level of tiss
11、ue preservation.（ a） NanoSIMS maps from a peripheral region of the leaf cross section, including a stomatal complex obtained using the Cs+ primary ion beam, and showing 16O-, 12C2- , 12C14N-, 31P- and 58Ni- ion maps, and a colour overlay for Ni and P. Scale bar: 10 m.(b) NanoSIMS maps obtained using
12、 the O- primary ion beam for the distribution of 23Na+, 24Mg+, 39K+, 40Ca+ and 58Ni+ signals, from a region of the leaf surface including a stomatal complex. The secondary electron (SE) image acquired with the Cs beam is included to show the morphology of the imaged region. Scale bar: 10 m. A heat scale for the images in panels (a) and (b) is shown on the right.
