1、 1 考生編 號 分數_ 2016 年國際生物奧林匹亞 國手選拔營實 作試題 第 1 試場 分子生物學 本 實作 考試 包括 三 部分 第 I 部分 限 制酶 切位 檢測 建構質 體組 成 (54 分) 第 II 部分 純化 電泳 瓊脂 膠 中的DNA片段(28 分) 第 III 部分 酵 母菌 雙雜 合實 驗(18 分) 要 完成 全部 三 部分 試題 ， 你必 須同 時進 行各 部分試 題 ， 建 議 先 進行 第 I 部 分 ， 空檔 時間 ，開 始 做 第 II 部分 ， 再 利用 空 檔作第 III 部分 。 2 實 驗所 需要 的器材 及藥 品 ， 都 已放在 桌上 ， 請按 照下
2、面 的清 單清 點。 若 有缺 少請 舉手告 訴評 審老 師。實 驗完 畢後 ，請將 用過 的器 材清洗 乾 淨並 放置 整齊。 實驗器材： 器 材 類 數量 藥品及材 料類 數量( l) 微量分注器 p20 1 支 無菌水 1 管 (100) 微量分注器 p1000 1 支 QG 溶液 1 管(800) p20 微量分注器吸管尖 30 支 PE 溶液 1 管(1600) p1000 微量分注器吸管尖 10 支 EB 溶液 1 管(45) 微量離心管 6 支 DNA 純化離心管組 2 組 以下藥品置於冰上 5X( 倍) 濃度限制酶反應 緩衝液 1 管(18) 馬克筆 1 支 PvuII 限制酶
3、 1 管(9) 計時器 2 個 XhoI 限制酶 1 管(9) 膠水 1 支 XbaI 限制酶 1 管(9) 迷你離心機 1 個 質體 A 1 管(3) 有編號的離心管水浴浮盤 1 個 質體 B 1 管(3) 有編號的培養皿( 盛裝膠片用) 1 個 質體 C 1 管(3) 電泳槽( 含電泳膠片) 1 個 DNA 加注染料( 標示:Dye) 1 管(24) 乾浴槽(50C) 公用 尺標 DNA( 標示:M) 1 管(24) 水浴槽(37C) 公用 片段 1 膠體 1 管 高速離心機 公用 片段 2 膠體 1 管 DNA 膠片照相系統 公用 請注意： 1. 請確認考 生編號是否正確；若有 誤，請舉
4、手請助教處理 。 2. 桌上的藥 品及器材用完後，將不 再補充。 3. 公用儀器 運用請依照指示使用。 4. 本試卷（ 含封面、試題卷）共 12 頁，於交卷時全部繳 回。 5. 作答時間 80 分鐘，請於本卷上 作答 。 試題答案可寫至 題目背面，但請註明並 標上題號。 3 第 I 部分 限 制酶 切位 檢測 建構質 體組 成 背景介紹 ： 在進行重組 DNA 實驗 時，我們會利用適當的限制酶切割載體和要接入的 DNA，經純化後， 再以 DNA 連接酶將其 接合 ， 得到預期的重組 DNA 。 我們希望在新載體 DNA ( 如圖 1) 的 XhoI 切位接入一個 DNA 片段 ( 如圖 2)
5、，且插入片 段的基因方向性和新載體上插入點所在區域的 方向性相同( 如圖 1、2 中箭頭標示) 。實驗部分，已先將新載體 DNA ( 如圖 1) 以限制酶 XhoI 切 開、純 化，要 插 入的 DNA 片段也以 XhoI 從 原來的載體上切下 、 純 化 。 將此二純化的 DNA 混 合，加 入 DNA 連接酶反應後 ， 轉殖入大腸 桿菌中 ， 得到三個轉殖 菌株 ：A 、B 和 C ， 從這 三種轉殖菌中分別得到質體 A 、質體 B 和質 體 C 。接下來我們要利 用限制酶切割來檢測這些 質體，藉由限制酶切出之 DNA 片段大小來判 定這三種質體的建構組成，例如：同向插入、 反向插入或是不
6、含插入片段。 圖1. 新載 體上相 關 限制酶切 位及各 切 位間距離( 單位：bp) ， 箭頭表 示插入 區方向性 。 XbaI XhoI PvuII PvuII 2510 246 139 819 圖2. 插入 片段上 相 關限制酶 切位及 各 切位間距 離(單 位：bp) ， 箭 頭表示 插入片段 方向性 。 XbaI XhoI 702 XhoI 79 4 QI-1.想知道三種質體的 建構組成，但只能進行一種切割方式，且只能使用 PvuII、XhoI 、XbaI 三種限制酶中的一種( 單切割 ，single digestion ，例 如 PvuII) ， 或是二 種限制酶同時切割( 雙切
7、割，double digestion， 例如 PvuII/XhoI) ，妳( 你) 的選擇為何？請在下列選項中勾選妳( 你) 的 切割方式：(8 分) QI-2.根據妳( 你) 的選擇 填寫限制酶切割反應設計( 對單一質體切割的配製量) ：(3 分) 使用單切割，限制酶使用量為 2 l ；使用雙切割，限制酶使用量為 4l ( 每種各 2 l) 提 示： 在進行限制酶反 應時，反應混合液內應 含 1X( 一倍) 濃度的限制 酶反應緩衝液 實驗步驟 ：（操作 6 分） 1. 依 QI-2 的設計配製限 制酶反應的混合液 ： 取一空微量離心管 ， 用馬克筆標記 A ， 按照無 菌 水、5X( 倍)
8、濃度反應緩衝液 、 限制酶的順序 各加入 QI-2 中填寫的三倍量於此微量離心 管，吸取不同溶液時，要用乾淨未用過的吸管尖，用微量分注器吸排混合。 2. 另取二空微量離心管 ， 分別標記 B 和 C ，用 P20 微量分注器將 A 管中的限制酶反應混合 液各取 18 l ，分別加入 B 和 C 管。 3. 分別用 P20 微量分注器吸取 2 l 的質體 A 、質 體 B 和質體 C 的 DNA ，對應加入已有限 制酶反應混合液的 A 、B 和 C 管中，用微量分注器吸排混合。每次吸取樣品時，要用乾 淨未用過的吸管尖。 4. 用迷你離心機將各管中混合液離心至管底部，離心時請平衡放置離心管於相對位
9、置。 5. 將反應混合液離心管放在有編號的水浴浮盤，置於 37 C 水浴槽中反應 30 分鐘( 以計時 器計時) ，利用等待時間回答問題，或進行第 II 部分實作題。 6. 當 30 分鐘反應時間終了時，從水浴槽取回你的樣品。 切割方式 PvuII XhoI XbaI PvuII/XhoI PvuII/XbaI XhoI/XbaI 答案勾選 配製成分 質體 DNA 5X( 倍) 濃度限制酶 反應緩衝液 無菌水 限制酶 總體積 使用量( l) 2 20 5 7. 用 P20 微量分注器在各反應樣品中分別加入 4l DNA 加注染料，以 分注器吸排混合。 8. 使用 P20 微量分注器，分別將尺標
10、 DNA 及已 加注染料的反應樣品( 各 20 l) ，依照尺標 DNA 、管 A 、管 B 、管 C 的順序 ， 由左至右注入電泳膠片的樣品凹槽中 。 空一個凹槽後 加入第 II 部分實作試題 的樣品。注意輕緩加入樣品，不要溢出槽外。(與第 II 部分樣品 一起進行) 9. 舉手示意實驗助教 ， 按照實驗助教指示設定連接電源 ， 進行電泳 25 分鐘 ， 請小心不要碰 觸電極。(與第 II 部分樣品一起 進行) 10. 開始電泳後，助教會依照妳( 你) 在 QI-1 勾選的 限制酶切割方式提供標準電泳結果圖，將 圖貼在下方空白處，並依照此圖回答以下問題。 11. 待電泳結束後，關閉電源，小心
11、取出完整膠片，放在標有編號的培養皿上，帶至膠片照 相處，交給實驗助教後直接回自己的實驗桌，電泳結果會由評分老師給分。 實驗結果 ：（16 分） 請將標準電泳結果圖黏貼於此 6 QI-3. 按照妳( 你) 在 QI-1 選擇的限制酶切割方式 ， 當質體中有插入圖 2 的片段 ， 且插入片段 的方 向與插入區方向相同時 ， 此質體在限制酶切割後 ， 產生的 DNA 各片 段長度(bp) 應該是多少 ？ 請依片段長度，由小到大列出 (6 分) QI-4. 依據 QI-1 的選擇 以及拿到的標準電泳結果圖和上方尺標 DNA 分離模式的標準圖(單 位：kb) ， 判定這三種質體的建構組成，在下表中勾選正
12、確的選項 (10 分) QI-5. 妳( 你) 知道在建 構質體時，是否有增加插入成功機率的方法嗎？(5 分) 質體 A 質體 B 質體 C 有插入圖 2 的片段 沒有插入圖 2 的片段 無法判定是否有插入圖 2 的片段 插入圖 2 的片段與圖 1 插入區方向相同 插入圖 2 的片段與圖 1 插入區方向相反 無法判定插入片段的方向 ( 如果有插入片段) 7 第 II 部分 純化 電泳 瓊脂 膠 中的 DNA 片段 背景介紹 ： 進行重組 DNA 實驗時 ，在以限制酶切割原有質體或 PCR 產物後， 需經瓊脂膠電泳分離所需 的 DNA 片 段，將 含這 些片段的區塊由電泳瓊脂膠中切下 ， 再將
13、DNA 自切下的膠塊中純化。 純化的過程包括：溶膠、DNA 片段吸附於矽 膠膜(silica-gel membrane) 、清洗、DNA 片段回 溶和收集。本實驗要從二個 DNA 膠塊中將 DNA 片段純化( 片段 1 和片段 2) ，再和第一部分 實驗的限制酶切割片段一起進行電泳分析，確認純化是否成功。 實驗步驟 ：（操作 6 分） 1. 用 P1000 微量分注器各吸取 360 l 的 QG 溶液 分別加入裝有片段 1 和片段 2 膠體的離心 管中，在管上註明你的考號。 2. 將步驟 1 離心管置於 50 C 乾浴槽中溶解膠體 ， 每隔 2 分鐘以手指輕彈離心管促進膠體溶 解，直到膠體完全
14、溶解 ( 通常會在 5 分鐘以內完全溶解) 。 3. 另取二組空 DNA 純化 離心管組 （如圖 A ） ， 不要拆開 ， 用馬克筆在上管( 淡紫色) 管蓋分別上標記 1 和 2。 4. 用 P1000 微量分注器將 步驟 2 溶解後的片段 1 和片段 2 膠體溶液分別加入標記 1 和 2 的 DNA 純化離心 管組上管內，蓋緊上蓋，下管請註明你的考號。 5. 將步驟 4 的 DNA 純化 離心管組 1 和 2 放入公用離心機，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘。將離心管組下管內溶液倒在廢液杯後，上管再套回下管。 6. 用 P1000 微量分注器在步驟 5 的 DNA 純化離 心管組 1
15、 和 2 的上管內 ， 分別加入 750 l 的 PE 溶液，蓋緊上蓋，靜置 5 分鐘後，放入公用離心機，以 12,000 rpm 離心 1 分鐘。 7. 將步驟 6 離心管組下管內溶液倒在廢液杯後 ， 上管再套回下管 。 再以公用離心 機 12,000 rpm 離心 1 分鐘。 8. 另取二空微量離心管 ， 分別標記 1 和 2 及考號 ，將 步驟 7 離心管組上管 1 和 2 分別置於空微量離心管 1 和 2 內（如圖 B ） ，下管丟棄。 9. 用 P20 微量分注器在步驟 8 離心管組上管 1 和 2 內分別加入 20 l 的 EB 溶液， 注意要完全覆蓋管內的白色膜 。 蓋緊上蓋 ，
16、 靜 置 3 分鐘後 ， 以公用離 心機 12,000 rpm 離心 1 分鐘，保留微量離心管內純化的 DNA 溶液。 圖 A 上管 下管 圖 B 空離心管 白色膜 8 10. 用 P20 微量分注器在步驟 9 微量離心管 1 和 2 溶液中分別加入 4 l DNA 加注染料，以分 注器吸排混合，待第 I 部分試題樣品完成限制酶反應後，一起進行電泳。 11. 使用 P20 微量分注器將步驟 10 的微量離心管 1 和 2 溶液（各 20 l ） ，接續尺標 DNA、管 A 、管 B 、管 C 之後， 跳過一個樣品凹槽，再依照片段 1、片段 2 的順序，分別加入樣品 凹槽中。注意輕緩加入樣品，不
17、要溢出槽外。 12. 舉手示意實驗助教，按照實驗助教指示設定連接電源，進行電泳 25 分鐘，請小心不要碰 觸電極。( 與第 I 部分樣 品一起進行) 13. 開始電泳後 ， 助教會提供標準電泳結果圖 ， 將圖貼在下方空白處 ， 並依照此圖回答以下問 題。 14. 待電泳結束後 ， 關閉電 源 ， 小心取出完整膠片 ， 放在標有編號的培養 皿上 ， 帶至膠片照相 處，交給實驗助教後直接回自己的實驗桌，電泳結果會由評分老師給分。 實驗結果 ：（12 分） 請將標準電泳結果圖黏貼於此 9 QII-1. 根據上方尺標 DNA 分離模式的標準圖(單 位：kb) ，推 估 此二 DNA 片段長度分別是多
18、少？ 以 kb 為單位，推估至一位小數。 (4 分) 片段 1： 片段 2： QII-2. 在步驟 1 以 QG 溶液去溶解膠體，而在步驟 9 使用 EB 溶液去 回收 DNA，妳( 你) 可否 推 測這二種溶液對 DNA 和 silica-gel membrane 之間的關係有何效應？ (6 分) 10 第 III 部分 酵母 菌雙 雜合 實驗 背景介紹 ： 一個轉錄因子蛋白包含二個功能區，一為 DNA 附著區(DNA binding domain，簡稱 BD) ；另 一為轉錄活化區(activation domain，簡稱 AD) ，這二個功能區可彼此分開，各自發揮功能。 1989 年 S
19、tanley Fields 利用酵母菌中的 Gal4 轉錄因子的二個功能區，提出” 酵母菌雙雜合實 驗”(The yeast two hybrid system) 來檢測二個蛋 白質之間是否會發生實質交互作用。他利用重 組 DNA 技術將 Gal4 的 BD 和特定蛋白質 X 雜合在一起(BD-X)，將 Gal4 的 AD 和特定 蛋白 質 Y 雜合在一起(AD-Y) 。 將這二個雜合蛋白同 時在酵母菌中表現 ，BD-X 會附著於 Gal4 辨認 的啟動子(promoter) ，若 蛋白 X 和蛋白 Y 會 發生實質交互作用 ， 則可將 AD-Y 帶到 Gal4 辨認 的啟動子 ， 因此引發啟
20、動子後的報導基因( reporter gene) 的表現 ， 藉由報導基因表現後對酵母 菌生長或外表型的效應 ， 可以讓實驗者 ” 觀察” 到蛋白 X 和蛋白 Y 的交互作用 。 現有二個酵 母菌蛋白質 H 和 T ， 我 們想利用” 酵母菌雙雜合實驗” 來檢測 H 和 T 之間是否會發生交互作用， 我們建構了二組雜合系統：第一組( 如圖 3 中的 ad) 將 T 與 AD 雜合(AD-T) ，H 與 BD 雜合 (BD-H) ， 搭配必要的控 制對照組 ； 第二組(如圖 3 中的 eh) 將 H 與 AD 雜合(AD-H) ，T 與 BD 雜合(BD-T) ，搭配必要 的控制對照組，圖 3
21、中各方格內的標示表示 ah 各菌株內表現的相關 蛋白。這二組系統使用同樣的酵母菌菌種進行檢測，所有的菌株都能生長在提供必要養分的 培養基上( 圖 4) ，唯有 當報導基因表現時才會使細胞生長在缺乏特定養分 adenine 的培養基 上 ( 圖 5) 。請依據圖 35 的訊息和實驗結果回答以下問題： 11 AD BD AD-T BD AD BD-H AD-H BD AD BD-T AD-T BD-H AD-H BD-T AD BD a b d c h g f e 圖3. 表現不同蛋白質 的酵母菌株 ah 在培養基上的排列位置。 方格內標記 各菌株所表現的” 酵母菌雙雜合實驗 “ 相關蛋白。 圖4. 表現 不同 蛋白 質的酵 母菌 株 ah 在提供 必要 養分 培養 基。 a b c d e f g h 圖5. 表現 不同 蛋白 質的酵 母菌 株 ah 在缺乏 特定 養分adenine培 養 基。 c d a b e f g h 12 QIII-1. 第一組的實驗 結果(ad) 是否支持 H 和 T 之間會發生交互作用，為甚麼？ (6 分) QIII-2. 第二組的實驗 結果(eh) 是否支持 H 和 T 之間會發生交互作用，為甚麼？(6 分) QIII-3. 是否可推測此 實驗中的報導基因，其表現出的蛋白質參與何種細胞功能？(6 分)
