1、外科学(骨科)专业优秀论文 少突胶质前体细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的实验研究关键词：脊髓损伤 脱髓鞘改变 少突胶质前体细胞 细胞移植 髓鞘化摘要：背景与目的: 脊髓损伤是一种常见的中枢神经系统损伤，可造成患者的感觉、运动等功能严重障碍，给自身、家庭和国家带来沉重的经济、社会负担。虽然大量基础实验研究对动物脊髓损伤的治疗取得了令人鼓舞的结果，但是临床治疗脊髓损伤的效果始终不令人满意。因此，积极开展脊髓损伤的治疗研究有着重要的科学和社会意义。 随着研究的深入人们认识到轴突脱髓鞘改变是临床和实验脊髓损伤的重要病理变化。外力作用脊髓后通常在软脊膜下存留部分相对正常的白质区域，多种继发性损伤因素的影响进一
2、步造成了残留神经纤维的脱髓鞘改变。研究表明脊髓损伤后轴突脱髓鞘改变与损伤局部少突胶质细胞死亡有着密切的联系。脊髓损伤不仅造成神经元的丢失，同时还导致少突胶质细胞大量的死亡进而引起神经轴突脱髓鞘改变。正常的髓鞘及髓鞘形成细胞对于神经轴突的功能发挥有着重要作用，因而脊髓损伤后少突胶质细胞死亡和轴突脱髓鞘改变进一步影响了残留神经纤维功能的正常发挥。上述研究分析表明，脊髓损后由于继发性损害和少突胶质细胞死亡而造成残留脊髓组织内轴突脱髓鞘改变，影响了存留神经纤维的功能发挥。因此，我们推测改善脊髓损伤后轴突髓鞘化可有助于损伤脊髓神经功能的恢复。 由于少突胶质细胞死亡是造成损伤脊髓轴突脱髓鞘改变的主要原因，
3、因而补充丢失的少突胶质细胞、改善残留神经轴突髓鞘化，有利于脱髓鞘神经轴突的功能恢复、最大限度地发挥残留神经纤维的作用，从而促进损伤脊髓神经功能的恢复。少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)是未成熟的少突胶质细胞，能够在体内增殖、迁移、最后分化为成熟少突胶质细胞并形成髓鞘发挥功能。OPCs作为移植细胞比成熟少突胶质细胞更具有优势，也不像干细胞那样容易受到移植微环境的不利影响。基于以上分析，本实验拟通过 OPCs 移植治疗改善损伤脊髓轴突髓鞘化，发挥残留神经纤维的功能，进而实现促进脊髓神经功能恢复的目的。通过本课题研究进一步加深对脊髓损伤轴突脱
4、髓鞘改变生物学意义的认识，并为今后脊髓损伤治疗研究提供一种新的思路。 方法: 1.取新生 48小时 Sprague-Dawley 大鼠大脑皮层细胞进行 OPCs 原代培养，通过相差显微镜和扫描电子显微镜连续观察体外条件下 OPCs 的生长情况。 2.实验采用振荡分离和差速贴壁等方法进一步分离 OPCs，通过免疫细胞化学技术对分离后的OPCs 进行分析鉴定。 3.OPCs 在体外化学条件培养基中继续生长，通过相差显微镜连续观察和免疫细胞化学技术检测研究分析体外条件下 OPCs 的定向分化规律和分化成熟情况，并采用 MTT 检测法研究分析 OPCs 在体外条件下的分裂增殖能力。 4.采用 Alle
5、n#39;s 打击法制作大鼠脊髓挫裂损伤模型，将实验大鼠分为四组，即 OPCs 移植治疗组、移植对照组、单纯损伤组及假手术组。在脊髓损伤术后第 7 天时将体外标记的 OPCs 移植治疗大鼠脊髓损伤。 5.通过 BBB 运动功能评分法连续评估脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的恢复情况，并采用神经电生理技术检测分析 OPCs 移植治疗对大鼠损伤脊髓神经传导功能恢复的影响。 6.OPCs 移植治疗术后 8 周时实验观察比较了各组大鼠损伤脊髓组织的大体病理变化情况，研究分析了 OPCs 移植治疗对大鼠损伤脊髓局部组织内白质存留的影响；实验采用免疫组织化学及免疫荧光技术检测分析了移植后OPCs 在体内的存活、
6、分布及分化成熟等情况；通过免疫组织化学、髓鞘染色、RT-PCR 及透射电镜技术等方法研究分析了 OPCs 移植治疗对大鼠损伤脊髓组织内髓鞘含量、髓鞘相关基因表达及轴突髓鞘化超微结构的影响；实验还观察研究了 OPCs 移植治疗对大鼠损伤脊髓内神经元、神经轴突和胶质反应的影响。 结果: 1.原代培养中 OPCs 大量增殖生长呈典型的前体细胞形态，镜下见其胞体呈近圆形，为折光性强的小亮点，胞体具有双极细胞突起。扫描电子显微镜观察见 OPCs 紧密贴附在星形胶质细胞表面生长，胞体较小呈近似圆形，直径约6-10m，胞体周围具有纤细的两极或三极细胞突起。 2.原代培养第 9-10 天时形成明显的细胞分层，
7、上层为成簇生长的 OPCs，下层为融合成片的星形胶质细胞。通过振荡分离和差速贴壁等方法分离获得了大量的 OPCs，免疫细胞化学检测结果显示分离后特异性表达 PDGFR-a 的 OPCs 比例达 95。 3.OPCs 能够在体外化学条件培养基内继续生长分化，胞体不断增大，细胞突起逐渐增多、增长并形成大量分支。在体外培养 5-7 天时 OPCs 逐渐定向分化为成熟的少突胶质细胞，镜下见其胞体呈圆形，胞体周围具有大量网状纤细突起，呈“分枝”状或“蜘蛛网”状分布于胞体四周。免疫细胞化学技术检测分析显示分化成熟的少突胶质细胞特异性表达主要髓鞘结构蛋白 MBP。 4.实验研究表明 OPCs在体外培养条件下
8、仍保持着良好的分裂增殖能力，MTT 检测结果显示观察期内OPCs 的细胞数量不断增加(plt;0.05)，实验观察初期 OPCs 的数量最少，在观察后期 OPCs 的数量逐渐增加，于第 6 天时细胞数量达到最多。 5.OPCs移植治疗组大鼠后肢运动功能的恢复情况明显好于移植对照组和单纯损伤组。脊髓损伤术后第 35、42、49 天时 OPCs 移植治疗组大鼠后肢运动功能的 BBB 评分情况比移植对照组结果更好(plt;0.05)；第 56 和 63 天时 OPCs 移植治疗组大鼠的后肢运动功能 BBB 评分结果明显好于移植对照组(plt;0.01)。 6.神经电生理检测结果表明 OPCs 移植治
9、疗组大鼠损伤脊髓神经传导功能的恢复亦明显好于移植对照组和单纯损伤组。移植治疗术后第 4 周时 OPCs 移植治疗组大鼠 MEPs N1 波峰潜时和波幅的结果要优于移植对照组(plt;0.05)；移植治疗术后第 8 周时 OPCs 移植治疗组大鼠 MEPs N1 波峰潜时和幅度的恢复情况均显著好于移植对照组(plt;0.01)。移植治疗术后第 2 和 4 周时 OPCs 移植治疗组大鼠 SSEPs N1 波波幅的恢复情况也较移植对照组更好(plt;0.05)：移植治疗术后第 8 周时 OPCs 移植治疗组大鼠 SSEPsNl 波峰潜时和波幅的结果也均明显优于移植对照组(plt;0.01)。 7.
10、移植治疗术后第 8 周时研究结果显示 OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓局部组织内存留的白质较移植对照组和单纯损伤组明显更多(plt;0.05)； OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓局部组织内可检测到 BrdU 阳性的移植细胞存活，移植的 OPCs 在大鼠损伤脊髓组织内广泛分布并与宿主组织良好整合；移植的 OPCs 能够在体内继续分化成熟并表达MBP； OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内 Oligo2 阳性的少突胶质细胞明显多于移植对照组(plt;0.01)。 8.OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内MBP 的表达量明显多于移植对照组(plt;0.01)，LFB 髓鞘染色结果也表明OPCs
11、移植治疗组大鼠脊髓组织内髓鞘的含量亦显著高于移植对照组(plt;0.01)； OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内 PLP 基因的表达水平较移植对照组明显增高(plt;0.01)。 9.透射电镜观察结果显示 OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内轴突髓鞘化有明显的改善。移植对照组大鼠损伤脊髓组织内存在大量脱髓鞘、肿胀退变的神经轴突，结构解离、髓鞘崩解。OPCs 移植治疗组大鼠脊髓组织内脱髓鞘的退变神经轴突更少，其髓鞘结构亦更接近于正常。 10. OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内 -Tubulin阳性的神经元和 NF200 阳性的神经轴突均明显多于移植对照组(plt;0.01)。OPCs
12、 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织局部内 GFAP 表达量和星形胶质细胞数量均明显低于移植对照组(plt;0.05)。 结论: 1.本实验建立了 OPCs 体外培养体系，通过适时的原代培养、恰当的振荡分离及差速贴壁等方法处理能够有效地分离获得 OPCs。 2.研究结果表明分离后 OPCs 能够在体外条件下继续存活生长，保持着良好的分裂增殖能力，并且能够在体外定向分化为成熟的少突胶质细胞。 3.OPCs 移植治疗能够促进脊髓损伤后大鼠后肢运动功能和脊髓神经传导功能的恢复。 4.移植术后 OPCs 能够在损伤脊髓内长期存活、分化成熟，与宿主组织良好的整合，并补充损伤脊髓组织内的少突胶质细胞。 5.OPC
13、s 移植治疗大鼠脊髓损伤有利于损伤脊髓组织内白质存留，改善损伤脊髓轴突髓鞘化，促进损伤脊髓组织内神经元和轴突存活及减轻胶质反应。正文内容背景与目的: 脊髓损伤是一种常见的中枢神经系统损伤，可造成患者的感觉、运动等功能严重障碍，给自身、家庭和国家带来沉重的经济、社会负担。虽然大量基础实验研究对动物脊髓损伤的治疗取得了令人鼓舞的结果，但是临床治疗脊髓损伤的效果始终不令人满意。因此，积极开展脊髓损伤的治疗研究有着重要的科学和社会意义。 随着研究的深入人们认识到轴突脱髓鞘改变是临床和实验脊髓损伤的重要病理变化。外力作用脊髓后通常在软脊膜下存留部分相对正常的白质区域，多种继发性损伤因素的影响进一步造成了
14、残留神经纤维的脱髓鞘改变。研究表明脊髓损伤后轴突脱髓鞘改变与损伤局部少突胶质细胞死亡有着密切的联系。脊髓损伤不仅造成神经元的丢失，同时还导致少突胶质细胞大量的死亡进而引起神经轴突脱髓鞘改变。正常的髓鞘及髓鞘形成细胞对于神经轴突的功能发挥有着重要作用，因而脊髓损伤后少突胶质细胞死亡和轴突脱髓鞘改变进一步影响了残留神经纤维功能的正常发挥。上述研究分析表明，脊髓损后由于继发性损害和少突胶质细胞死亡而造成残留脊髓组织内轴突脱髓鞘改变，影响了存留神经纤维的功能发挥。因此，我们推测改善脊髓损伤后轴突髓鞘化可有助于损伤脊髓神经功能的恢复。 由于少突胶质细胞死亡是造成损伤脊髓轴突脱髓鞘改变的主要原因，因而补充
15、丢失的少突胶质细胞、改善残留神经轴突髓鞘化，有利于脱髓鞘神经轴突的功能恢复、最大限度地发挥残留神经纤维的作用，从而促进损伤脊髓神经功能的恢复。少突胶质前体细胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)是未成熟的少突胶质细胞，能够在体内增殖、迁移、最后分化为成熟少突胶质细胞并形成髓鞘发挥功能。OPCs 作为移植细胞比成熟少突胶质细胞更具有优势，也不像干细胞那样容易受到移植微环境的不利影响。基于以上分析，本实验拟通过 OPCs 移植治疗改善损伤脊髓轴突髓鞘化，发挥残留神经纤维的功能，进而实现促进脊髓神经功能恢复的目的。通过本课题研究进一步加深对脊髓损伤轴突脱髓鞘改
16、变生物学意义的认识，并为今后脊髓损伤治疗研究提供一种新的思路。 方法: 1.取新生 48 小时Sprague-Dawley 大鼠大脑皮层细胞进行 OPCs 原代培养，通过相差显微镜和扫描电子显微镜连续观察体外条件下 OPCs 的生长情况。 2.实验采用振荡分离和差速贴壁等方法进一步分离 OPCs，通过免疫细胞化学技术对分离后的 OPCs进行分析鉴定。 3.OPCs 在体外化学条件培养基中继续生长，通过相差显微镜连续观察和免疫细胞化学技术检测研究分析体外条件下 OPCs 的定向分化规律和分化成熟情况，并采用 MTT 检测法研究分析 OPCs 在体外条件下的分裂增殖能力。 4.采用 Allen#3
17、9;s 打击法制作大鼠脊髓挫裂损伤模型，将实验大鼠分为四组，即 OPCs 移植治疗组、移植对照组、单纯损伤组及假手术组。在脊髓损伤术后第 7 天时将体外标记的 OPCs 移植治疗大鼠脊髓损伤。 5.通过BBB 运动功能评分法连续评估脊髓损伤后大鼠后肢运动功能的恢复情况，并采用神经电生理技术检测分析 OPCs 移植治疗对大鼠损伤脊髓神经传导功能恢复的影响。 6.OPCs 移植治疗术后 8 周时实验观察比较了各组大鼠损伤脊髓组织的大体病理变化情况，研究分析了 OPCs 移植治疗对大鼠损伤脊髓局部组织内白质存留的影响；实验采用免疫组织化学及免疫荧光技术检测分析了移植后 OPCs在体内的存活、分布及分
18、化成熟等情况；通过免疫组织化学、髓鞘染色、RT-PCR 及透射电镜技术等方法研究分析了 OPCs 移植治疗对大鼠损伤脊髓组织内髓鞘含量、髓鞘相关基因表达及轴突髓鞘化超微结构的影响；实验还观察研究了OPCs 移植治疗对大鼠损伤脊髓内神经元、神经轴突和胶质反应的影响。 结果: 1.原代培养中 OPCs 大量增殖生长呈典型的前体细胞形态，镜下见其胞体呈近圆形，为折光性强的小亮点，胞体具有双极细胞突起。扫描电子显微镜观察见 OPCs 紧密贴附在星形胶质细胞表面生长，胞体较小呈近似圆形，直径约6-10m，胞体周围具有纤细的两极或三极细胞突起。 2.原代培养第 9-10 天时形成明显的细胞分层，上层为成簇
19、生长的 OPCs，下层为融合成片的星形胶质细胞。通过振荡分离和差速贴壁等方法分离获得了大量的 OPCs，免疫细胞化学检测结果显示分离后特异性表达 PDGFR-a 的 OPCs 比例达 95。 3.OPCs 能够在体外化学条件培养基内继续生长分化，胞体不断增大，细胞突起逐渐增多、增长并形成大量分支。在体外培养 5-7 天时 OPCs 逐渐定向分化为成熟的少突胶质细胞，镜下见其胞体呈圆形，胞体周围具有大量网状纤细突起，呈“分枝”状或“蜘蛛网”状分布于胞体四周。免疫细胞化学技术检测分析显示分化成熟的少突胶质细胞特异性表达主要髓鞘结构蛋白 MBP。 4.实验研究表明 OPCs在体外培养条件下仍保持着良
20、好的分裂增殖能力，MTT 检测结果显示观察期内OPCs 的细胞数量不断增加(plt;0.05)，实验观察初期 OPCs 的数量最少，在观察后期 OPCs 的数量逐渐增加，于第 6 天时细胞数量达到最多。 5.OPCs移植治疗组大鼠后肢运动功能的恢复情况明显好于移植对照组和单纯损伤组。脊髓损伤术后第 35、42、49 天时 OPCs 移植治疗组大鼠后肢运动功能的 BBB 评分情况比移植对照组结果更好(plt;0.05)；第 56 和 63 天时 OPCs 移植治疗组大鼠的后肢运动功能 BBB 评分结果明显好于移植对照组(plt;0.01)。 6.神经电生理检测结果表明 OPCs 移植治疗组大鼠损
21、伤脊髓神经传导功能的恢复亦明显好于移植对照组和单纯损伤组。移植治疗术后第 4 周时 OPCs 移植治疗组大鼠 MEPs N1 波峰潜时和波幅的结果要优于移植对照组(plt;0.05)；移植治疗术后第 8 周时 OPCs 移植治疗组大鼠 MEPs N1 波峰潜时和幅度的恢复情况均显著好于移植对照组(plt;0.01)。移植治疗术后第 2 和 4 周时 OPCs 移植治疗组大鼠 SSEPs N1 波波幅的恢复情况也较移植对照组更好(plt;0.05)：移植治疗术后第 8 周时 OPCs 移植治疗组大鼠 SSEPsNl 波峰潜时和波幅的结果也均明显优于移植对照组(plt;0.01)。 7.移植治疗术
22、后第 8 周时研究结果显示 OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓局部组织内存留的白质较移植对照组和单纯损伤组明显更多(plt;0.05)； OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓局部组织内可检测到 BrdU 阳性的移植细胞存活，移植的 OPCs 在大鼠损伤脊髓组织内广泛分布并与宿主组织良好整合；移植的 OPCs 能够在体内继续分化成熟并表达MBP； OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内 Oligo2 阳性的少突胶质细胞明显多于移植对照组(plt;0.01)。 8.OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内MBP 的表达量明显多于移植对照组(plt;0.01)，LFB 髓鞘染色结果也表明OPCs 移植治疗组
23、大鼠脊髓组织内髓鞘的含量亦显著高于移植对照组(plt;0.01)； OPCs 移植治疗组大鼠损伤脊髓组织内 PLP 基因的表达水平较移植对照组明显增高(plt;0.01)。特别提醒 ：正文内容由 PDF 文件转码生成，如您电脑未有相应转换码，则无法显示正文内容，请您下载相应软件，下载地址为 http:/ 。如还不能显示，可以联系我 q q 1627550258 ，提供原格式文档。我们还可提供代笔服务，价格优惠，服务周到，包您通过。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌甸?*U 躆 跦?l, 墀 VGi?o 嫅#4K 錶 c#x 刔 彟 2Z 皙笜?D 剧珞 H 鏋 Kx
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