1、药物化学专业毕业论文 精品论文 Tat 蛋白上肝素新结合位点的确定及其功能研究关键词:Tat 蛋白 艾滋病 抑制免疫细胞 计算机分子模拟摘要:艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的人体免疫系统衰退性恶性传染病,其流行形势仍然十分严峻。研究表明,Tat 蛋白在艾滋病发生发展过程中具有重要作用。作为 HIV 的最主要的调节蛋白,Tat 不但通过反式激活效应参与病毒基因的复制和表达,还可以分泌到胞外,抑制免疫细胞的分化和增殖,诱导其凋亡,激活静止的 CD4+T 细胞,利于 HIV 的感染和体内传播,同时还能使正常或变形的血管内皮细胞延伸、诱导血管生成或炎症发生,促进卡波氏肉瘤肿瘤细胞的发生、生长,
2、直接或间接作用于皮质层和皮质下层区引起神经系统的损害,导致艾滋病痴呆,诱发肿瘤等。 肝素/硫酸乙酰肝素(heparin/HS)一直以来被认为是 Tat 蛋白发挥功能的分子伴侣。广泛存在各细胞膜表面的 HSPG是 Tat 蛋白的受体,对 Tat 在细胞表面的富集、内化及随后 HIV-LTR 转录激活是必须的;反之,游离的 heparin/HS 可以竞争性结合胞外的 Tat 抑制其与细胞膜表面 HSPG 的结合。细胞外基质中的 heparin/HS 可以促进 Tat 蛋白在基质中积聚,增强内皮细胞的活化、生长、黏附和血管生成。长期以来 Tat 上的碱性氨基酸区被认为是唯一的肝素结合位点,但近期研究
3、发现对碱性氨基酸富含区进行缺失或替换突变虽然影响结合但不足以阻断二者的相互作用,提示,除碱性氨基酸富含区外,Tat 蛋白上还存在其它肝素结合位点。进一步确定 Tat 蛋白上其它 Heparin 结合位点,并探讨其在 Tat 功能中的作用,对阐明 Tat-heparin 相互作用的本质以及针对于 Tat 靶点的抗艾滋病药物的研制都具有重要意义。 本论文以计算机分子模拟为指引,借助分子生物学和生物芯片技术,首次发现了 Tat 蛋白上一个全新的由 Lys12,Lys41,Arg78 组成的空间三联体、高亲和力肝素结合位点(KKR 区),这是继 Tat 蛋白已知肝素结合位点(碱性氨基酸区)之后发现的另
4、一全新位点。KKR 区在序列上远离、但空间却毗邻相连。深入的生物学功能研究表明,KKR 位点不影响 Tat 的内化过程,但可通过与细胞膜硫酸乙酰肝素结合,利于 Tat 介导的整合素活化,促进卡波氏肉瘤细胞的粘附能力。 1、Tat 蛋白上 Heparin 新结合位点的发现及确证 (1)计算机模拟 Tat 上 Heparin 结合位点,预测了 KKR 区是 heparin 的新结合位点 在 Tat蛋白 NMR 溶液构象基础上,我们建立了 Tat 蛋白同源模型作为分子模拟中的目标蛋白,以肝素 2、4、6、8 寡糖片段为探针进行了对接。结果发现,Tat 蛋白上除了已知的肝素结合位点-序列线性相连的碱性
5、氨基酸区外,还首次揭示了一个新的由 Lys12,Lys41,Arg78 构成的空间三联体位点(KKR 区),其在序列上远离、但空间却毗邻相连。 (2)Tat 及其系列突变体蛋白的制备 在计算机模拟的指导下,设计了新位点的单点、双点、三点突变以及碱性氨基酸区与KKR 区的共突变体,随后利用分子生物学技术,构建并表达纯化了相关蛋白,并采用质谱技术对主要蛋白进行了鉴定,证明各突变体蛋白突变成功,为 Tat蛋白上肝素新结合位点的揭示奠定了物质基础。 (3)SPR 技术确证了 KKR 区是 Tat 上 Heparin 的新结合位点 随后我们利用 SPR 技术观察了 GST-Tat 及其突变体与芯片 He
6、parin 的结合情况,对新位点进行了确证,并对其特性进行了考察。结果发现,GST-Tat 蛋白与 Heparin 呈多相结合,表明 Tat 蛋白上存在多个 Heparin 结合位点,同时当碱性氨基酸区突变后(GST-Tat(G48-R57)A),其与 Heparin 呈单相结合,可见除了已知的碱性氨基酸区外,Tat 蛋白上尚存在另一个 Heparin 结合位点。对 Lys12,Lys41,Arg78 进行单一突变时(GST-TatK(12,41)A/R78A),其与 Heparin 的结合能力显著下降,将其与碱性氨基酸区共同突变时(GST-Tatc(G48-R57)A/K(12,41)A/R
7、7SA),Tat 蛋白与 Heparin结合能力完全消除,表明 Tat 蛋白上确实存在除碱性氨基酸区之外的另一个Heparin 结合位点(即由 Lys12,Lys41,Arg78 组成的 KKR 区)。在此基础上,我们进一步采用亲和力比较的策略,评价了 KKR 区中每个氨基酸残基在与Heparin 相互作用中的贡献。研究发现,KKR 区进行单点突变时,蛋白质与Heparin 结合的亲和力均有部分降低;双点突变时,蛋白质与 Heparin 结合的亲和力呈明显降低;当 Lys12,Lys41,Arg78 三个氨基酸全部突变后,二者的亲和力则显著降低。上述研究表明 Lys12,Lys41,Arg78
8、 三个氨基酸残基在KKR 区与 Heparin 的结合中均发挥了重要的作用。 (4)KKR 区为 Heparin 高亲和力特异性结合位点 亲和力的大小是结合模式中一个重要的评价指标,所以我们观察了新发现的 KKR 区与 Heparin 结合的亲和力,即单纯突变碱性氨基酸区后计算二者的亲和力,通过动力学的分析,表明 KKR 区以极高的亲和力与Heparin 结合(5.31pM),其大小约为碱性氨基酸区与 Heparin 结合亲和力的10000 倍(32.6nM),两个区域亲和力之间的悬殊差异使 Heparin 与 Tat 蛋白结合时优先占据碱性氨基酸区。竞争性抑制实验是研究分子间相互作用的经典实
9、验,其结果显示 Heparin 对 GST-Tat、GST-Tat(G48-R57)A 与芯片 Heparin 结合的 IC50 值基本相同,而 Heparin 对 GST-TatK(12,41)A/R78A 与芯片 Heparin结合的 IC50 值则有较大变化,基本达到其对 GST-Tat 半数抑制浓度的两倍,提示 KKR 区突变后对 Tat 蛋白与 Heparin 结合影响较为明显,也从另一个方面表明 KKR 区是 Tat 蛋白与 Heparin 的更高的亲和力位点。在计算机对接试验中也清晰的表明了这点,当探针为 2 糖片段时,其特异性识别 KKR 区,随着糖链的增长,它在占据 KKR
10、区的前提下逐渐向碱性氨基酸区延伸,当探针为 4 糖时,它到达 Arg49;当为 6 糖时,探针接近了 Arg52;当为 8 糖时,探针延伸到了Gln54。 分子间结合的特异性研究发现,HS 能够竞争抑制 KKR 区(GST-Tat(G48-R57)A)与芯片 Heparin 的结合,而 CSA、CSC、HA 即使在浓度高达250g/ml 时则仅呈现较低的抑制作用,说明 KKR 区与 Heparin/HS 的结合具有一定的结构与位点特异性。 2、生物学功能研究发现,KKR 位点不影响 Tat的内化过程,但可通过与细胞膜硫酸乙酰肝素结合,利于 Tat 介导的整合素活化,促进卡波氏肉瘤细胞的粘附能力
11、 (1)KKR 区不影响 Tat 蛋白的内化功能 Tat 蛋白内化是其发挥胞内功能的前提。我们首先观察了 KKR 区在 Tat 蛋白介导内化过程中的作用。结果表明,与碱性氨基酸区不同,KKR 区不影响 Tat 蛋白的内化。 (2)KKR 区通过与细胞膜 HSPG 结合,利于 Tat 介导的整合素活化,进而促进卡波氏肉瘤细胞的粘附 此外,Tat 蛋白作为胞外基质,通过其RGD(78-80)区结合激活整合素家族,促进卡波氏肉瘤细胞的黏附,特别是基于KKR 区恰有一位氨基酸落于 RGD 区,为此,我们进一步观察了 KKR 区对 Tat 介导的细胞黏附的影响。结果表明,KKR 区突变后整合素的活化及其
12、介导的黏附效应均有所降低;进一步利用竞争抑制试验考察 Heparin 结合特性在其中的贡献。研究发现,外加 Heparin 或使用特异性抗体封闭细胞表面 HSPG 后,KKR 区促进的整合素活化及所介导的黏附效应均受到抑制,表明 KKR 区通过与细胞膜HSPG 结合,介导 Tat 与整合素结合活化,进而促进卡波氏肉瘤细胞粘附。 综上所述,本论文综合利用计算机辅助技术、分子生物学技术和 SPR 技术,首次发现了 Tat 蛋白上一个全新的由 Lys12,Lys41,Arg78 组成的空间三联体、高亲和力肝素结合位点(KKR 区),这是继 Tat 蛋白已知肝素结合位点(碱性氨基酸区)之后发现的另一全
13、新位点;不同于已知的碱性氨基酸区结合位点,KKR 区在序列上远离、但空间却毗邻相连,是亲和力更高的肝素结合位点;进一步的功能研究表明 KKR 区不参与 Tat 的内化功能,但可通过与细胞膜硫酸乙酰肝素结合,利于 Tat 介导的整合素的活化,促进卡波氏肉瘤细胞的粘附能力。 本论文为阐明 Tat-heparin 相互作用的本质及其在艾滋病发病过程中的作用奠定了重要基础,同时也为靶向 Tat 蛋白的抗艾滋病药物的理性设计提供了重要的模板和理论依据。正文内容艾滋病是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的人体免疫系统衰退性恶性传染病,其流行形势仍然十分严峻。研究表明,Tat 蛋白在艾滋病发生发展过程中具有重要
14、作用。作为 HIV 的最主要的调节蛋白,Tat 不但通过反式激活效应参与病毒基因的复制和表达,还可以分泌到胞外,抑制免疫细胞的分化和增殖,诱导其凋亡,激活静止的 CD4+T 细胞,利于 HIV 的感染和体内传播,同时还能使正常或变形的血管内皮细胞延伸、诱导血管生成或炎症发生,促进卡波氏肉瘤肿瘤细胞的发生、生长,直接或间接作用于皮质层和皮质下层区引起神经系统的损害,导致艾滋病痴呆,诱发肿瘤等。 肝素/硫酸乙酰肝素(heparin/HS)一直以来被认为是 Tat 蛋白发挥功能的分子伴侣。广泛存在各细胞膜表面的 HSPG是 Tat 蛋白的受体,对 Tat 在细胞表面的富集、内化及随后 HIV-LTR
15、 转录激活是必须的;反之,游离的 heparin/HS 可以竞争性结合胞外的 Tat 抑制其与细胞膜表面 HSPG 的结合。细胞外基质中的 heparin/HS 可以促进 Tat 蛋白在基质中积聚,增强内皮细胞的活化、生长、黏附和血管生成。长期以来 Tat 上的碱性氨基酸区被认为是唯一的肝素结合位点,但近期研究发现对碱性氨基酸富含区进行缺失或替换突变虽然影响结合但不足以阻断二者的相互作用,提示,除碱性氨基酸富含区外,Tat 蛋白上还存在其它肝素结合位点。进一步确定 Tat 蛋白上其它 Heparin 结合位点,并探讨其在 Tat 功能中的作用,对阐明 Tat-heparin 相互作用的本质以及
16、针对于 Tat 靶点的抗艾滋病药物的研制都具有重要意义。 本论文以计算机分子模拟为指引,借助分子生物学和生物芯片技术,首次发现了 Tat 蛋白上一个全新的由 Lys12,Lys41,Arg78 组成的空间三联体、高亲和力肝素结合位点(KKR 区),这是继 Tat 蛋白已知肝素结合位点(碱性氨基酸区)之后发现的另一全新位点。KKR 区在序列上远离、但空间却毗邻相连。深入的生物学功能研究表明,KKR 位点不影响 Tat 的内化过程,但可通过与细胞膜硫酸乙酰肝素结合,利于 Tat 介导的整合素活化,促进卡波氏肉瘤细胞的粘附能力。 1、Tat 蛋白上 Heparin 新结合位点的发现及确证 (1)计算
17、机模拟 Tat 上 Heparin 结合位点,预测了 KKR 区是 heparin 的新结合位点 在 Tat蛋白 NMR 溶液构象基础上,我们建立了 Tat 蛋白同源模型作为分子模拟中的目标蛋白,以肝素 2、4、6、8 寡糖片段为探针进行了对接。结果发现,Tat 蛋白上除了已知的肝素结合位点-序列线性相连的碱性氨基酸区外,还首次揭示了一个新的由 Lys12,Lys41,Arg78 构成的空间三联体位点(KKR 区),其在序列上远离、但空间却毗邻相连。 (2)Tat 及其系列突变体蛋白的制备 在计算机模拟的指导下,设计了新位点的单点、双点、三点突变以及碱性氨基酸区与KKR 区的共突变体,随后利用
18、分子生物学技术,构建并表达纯化了相关蛋白,并采用质谱技术对主要蛋白进行了鉴定,证明各突变体蛋白突变成功,为 Tat蛋白上肝素新结合位点的揭示奠定了物质基础。 (3)SPR 技术确证了 KKR 区是 Tat 上 Heparin 的新结合位点 随后我们利用 SPR 技术观察了 GST-Tat 及其突变体与芯片 Heparin 的结合情况,对新位点进行了确证,并对其特性进行了考察。结果发现,GST-Tat 蛋白与 Heparin 呈多相结合,表明 Tat 蛋白上存在多个 Heparin 结合位点,同时当碱性氨基酸区突变后(GST-Tat(G48-R57)A),其与 Heparin 呈单相结合,可见除
19、了已知的碱性氨基酸区外,Tat 蛋白上尚存在另一个 Heparin 结合位点。对 Lys12,Lys41,Arg78 进行单一突变时(GST-TatK(12,41)A/R78A),其与 Heparin 的结合能力显著下降,将其与碱性氨基酸区共同突变时(GST-Tatc(G48-R57)A/K(12,41)A/R7SA),Tat 蛋白与 Heparin结合能力完全消除,表明 Tat 蛋白上确实存在除碱性氨基酸区之外的另一个Heparin 结合位点(即由 Lys12,Lys41,Arg78 组成的 KKR 区)。在此基础上,我们进一步采用亲和力比较的策略,评价了 KKR 区中每个氨基酸残基在与He
20、parin 相互作用中的贡献。研究发现,KKR 区进行单点突变时,蛋白质与Heparin 结合的亲和力均有部分降低;双点突变时,蛋白质与 Heparin 结合的亲和力呈明显降低;当 Lys12,Lys41,Arg78 三个氨基酸全部突变后,二者的亲和力则显著降低。上述研究表明 Lys12,Lys41,Arg78 三个氨基酸残基在KKR 区与 Heparin 的结合中均发挥了重要的作用。 (4)KKR 区为 Heparin 高亲和力特异性结合位点 亲和力的大小是结合模式中一个重要的评价指标,所以我们观察了新发现的 KKR 区与 Heparin 结合的亲和力,即单纯突变碱性氨基酸区后计算二者的亲和
21、力,通过动力学的分析,表明 KKR 区以极高的亲和力与Heparin 结合(5.31pM),其大小约为碱性氨基酸区与 Heparin 结合亲和力的10000 倍(32.6nM),两个区域亲和力之间的悬殊差异使 Heparin 与 Tat 蛋白结合时优先占据碱性氨基酸区。竞争性抑制实验是研究分子间相互作用的经典实验,其结果显示 Heparin 对 GST-Tat、GST-Tat(G48-R57)A 与芯片 Heparin 结合的 IC50 值基本相同,而 Heparin 对 GST-TatK(12,41)A/R78A 与芯片 Heparin结合的 IC50 值则有较大变化,基本达到其对 GST-
22、Tat 半数抑制浓度的两倍,提示 KKR 区突变后对 Tat 蛋白与 Heparin 结合影响较为明显,也从另一个方面表明 KKR 区是 Tat 蛋白与 Heparin 的更高的亲和力位点。在计算机对接试验中也清晰的表明了这点,当探针为 2 糖片段时,其特异性识别 KKR 区,随着糖链的增长,它在占据 KKR 区的前提下逐渐向碱性氨基酸区延伸,当探针为 4 糖时,它到达 Arg49;当为 6 糖时,探针接近了 Arg52;当为 8 糖时,探针延伸到了Gln54。 分特别提醒 :正文内容由 PDF 文件转码生成,如您电脑未有相应转换码,则无法显示正文内容,请您下载相应软件,下载地址为 http:
23、/ 。如还不能显示,可以联系我 q q 1627550258 ,提供原格式文档。“垐垯櫃 换烫梯葺铑?endstreamendobj2x 滌?U 閩 AZ箾 FTP 鈦X 飼?狛P? 燚?琯嫼 b?袍*甒?颙嫯?4)=r 宵?i?j 彺帖 B3 锝檡骹笪 yLrQ#?0 鯖 l 壛枒l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛枒 l 壛渓?擗#?“?# 綫 G 刿#K 芿$?7. 耟?Wa 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 皗 E|?pDb 癳$Fb 癳$Fb癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$Fb 癳$F?責鯻 0 橔 C,f 薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵秾腵薍秾腵%?秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍秾腵薍