1、双靶向 CdTe 量子点的制备及其在细胞标记中的应用 杨冬芝 王文文 杜岩 纪海侠 徐州医科大学药物分析教研室 徐州医科大学新药研究与临床药学重点实验室 摘 要： 以巯基乙酸和巯基乙酰肼为稳定剂, 制备了酸度敏感型 CdTe 量子点。经与抗体链接, 该量子点具备酸度敏感、免疫识别双重靶向功能。经荧光光谱分析、透射电镜图像及细胞免疫成像证明, 抗体已成功链接于量子点表面, 且该量子点具有酸度敏感及抗体识别的双重靶向功能, 可以实现对肿瘤细胞的特异性标记。关键词： CdTe 量子点; 酸度敏感性; 免疫靶向; 作者简介：杨冬芝, E-mail:收稿日期：2016-12-09基金：国家自然科学基金
2、(81201696) The Preparation of Dual Targeting CdTe Quantum Dots and Its Application in Cells LabelingYANG Dongzhi WANG Wenwen DU Yan JI Haixia Department of Pharmaceutical Analysis, Xuzhou Medical University; Jiangsu Key Laboratory of New Drug Research and Clinical Pharmacy, Xuzhou Medical University
3、; Abstract： The pH sensitive CdTe quantum dots (QDs) were prepared with thioglycolic acid (TGA) and mercapto-acetohydrazide (TGH) as the stabilizers.After being conjugated with antibody, the prepared CdTe QDs has both functions of pH sensitivity and immune recognition.The results of fluorescence lum
4、inescence (FL) , transmission electron microscopy (TEM) and cells labeling imaging showed that antibody was successfully conjugated on the surface of CdTe QDs.The prepared dual targeting QDs can be used to identify the acidic interstitial extracellular environment and label tumor cells specifically.
5、Keyword： CdTe quantum dots; pH sensitivity; immune recognition; Received： 2016-12-09量子点具有良好的光学性能, 可以应用于细胞标记1,2及活体成像3,4等领域。但其纳米粒径和丰富的表面电荷决定了它在细胞表面的强烈吸附和被细胞吞噬的可能。量子点未经修饰前生物相容性差, 对细胞及生物体产生一定的毒性5。研究表明, 量子点的生物安全性与其本身的稳定性、尺寸和表面性质有关, CdTe 量子点经聚合物或生物大分子表面修饰后可以大大提高其生物相容性6, 未发现对生物组织器官产生明显损伤, 可以实际应用于活体检测。因此, 改
6、善量子点表面性质、增加特异性基团不仅可以提高其生物相容性, 也是实现量子点对肿瘤细胞定向识别的有效策略7-10。本课题组11利用巯基乙酸 (TGA) 与巯基乙酰肼 (TGH) 为双稳定剂制备了TGA/TGH-CdTe QDs, 并经功能化聚乙二醇 (mPEG) 修饰制备了酸度敏感性 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 量子点。为提高纳米材料的特异性, 纳米材料表面可以修饰抗体12-15、多肽16、多糖17等功能基团实现肿瘤的特异性识别。TGA/TGH-CdTe QDs 中的 TGA 和 TGH 可以同时分别与抗体和 mPEG 醛链接, 作者在前期实验的基础上, 利用 mPEG 醛与抗体共
7、同链接的方法构建 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 双靶向纳米量子点。mPEG 醛与巯基乙酰肼形成的腙键具有酸度敏感性, 使得量子点在不链接生物大分子的情况下就可以特异性识别肿瘤微酸性环境;而量子点链接抗体后, 在肿瘤微环境下, 腙键不但会发生断裂, 并且抗体可以特异性地将纳米量子点引入细胞, 实现双靶向定位和荧光成像, 因此, 本工作的成果在细胞标记和体内成像方面均具有较大的应用价值。1 实验部分1.1 仪器与试剂FL4600 型荧光分光光度计 (日本岛津制作所) 、G2 T12 透射电镜 (美国 FEI 有限责任公司) 、BX43F 光学显微镜 (日本奥林巴斯株式会社) 、
8、1600R 数码凝胶图像处理系统图 (上海天能科技有限公司) 、3111 细胞培养箱 (美国赛默飞世尔科技公司) 和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAEG) 系统 (美国BIO-RAD 公司) 。人宫颈癌细胞 (HeLa 细胞) 由徐州医科大学附属医院惠赠;兔抗人 CEA 抗体 (Anti-CEA Abs) 购自北京博奥森生物技术有限公司;SDS-PAEG 凝胶配制试剂盒、10SDS-PAEG 电泳液和蛋白快速染色试剂盒均购自南京建成科技有限公司;Mini-PROTEANTGX 预制胶购自美国 BIO-RAD 公司;1- (3-二甲氨基丙基) -3-乙基碳二亚胺 (EDC, 纯
9、度98%) 购自东京化成工业株式会社;聚乙二醇 4000 (mPEG) 、巯基乙酸 (TGA) 、巯基乙酸乙酯和 80%水合肼均购自西陇化工股份有限公司;巯基乙酰肼 (TGH) 由实验室自制;其他化学试剂均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限公司。实验用水为双蒸水。1.2 实验方法1.2.1 双靶向 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 的构建依照文献11方法制备酸度敏感 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs。TGA/TGH-CdTe QDs 的制备:氯化镉 0.182g (1mmol) 溶于 180mL 水, 在氮气保护下与新制备的巯基乙酰肼水溶液和 36L 巯基乙酸搅拌充分
10、混合, 用 1 mol/L 氢氧化钠调节 pH 值至9.0, 加入新制备的碲氢化钠上清液, 得 TGA/TGH-CdTe QDs 前驱体。取一定量CdTe QDs 前驱体加入到聚四氟乙烯消化罐中, 将消化罐密封后置入 140烘箱, 加热 40 min, 自然冷却至室温后, 即生成 TGA/TGH-CdTe 量子点溶液。酸度敏感基团、抗体与 TGA/TGH-CdTe 量子点链接制备双靶向 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 量子点:取实验室自制的 TGA/TGH-CdTe 量子点溶液 500L 加入 4 mg/mL 的 EDC 溶液 25L 中, 室温活化 10min 后, 加入
11、1mg/mL 兔抗人 CEA 溶液200L 和 0.4g/mL 的 mPEG 醛溶液 25L, 室温振摇过夜, PD-10 凝胶柱分离纯化, 即得双靶向 PEG-TGA/TGH-CdTe QDsAbs 量子点。1.2.2 SDS-PAEG 电泳对 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 链接效果的评价采用 4%12%BIO-RAD 梯度预制胶, 上样量为 25L, 恒定电压 80V, 分离90min。电泳结束后, 用凝胶成像系统对凝胶进行透射拍照, 经考马斯亮蓝染色后脱色拍照。1.2.3 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 的光学及结构性能表征利用荧光分光光度计测定量子
12、点溶液的荧光光谱 ( ex=350nm) , 高分辨透射电镜对其粒径及形貌进行表征。1.2.4 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 对于细胞的标记应用HeLa 细胞在 37下 5%CO2恒温培养箱内培养, 使用 DMEM 高糖完全培养液 (含10%体积胎牛血清、100 U/mL 青霉素、100g/mL 链霉素) 进行培养。取生长状态良好的对数生长期细胞进行细胞接种和标记。将细胞爬片置于 24 孔培养板, 取生长良好的对数生长期细胞接种, 置于细胞培养箱内培养 24h 使细胞贴壁。弃除培养液, PBS 清洗后分别加入 pH=6.5、7.4的培养基 500L (不含 10%胎牛血清)
13、 , 再分别加入 TGA/TGH-CdTe QDs、PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 和 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 各 100L, 摇匀孵育 30 min。吸弃溶液, PBS 洗涤 2 遍, 取出爬片置于载玻片上, 荧光显微镜下观察并摄片记录。2 结果与讨论2.1 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 酸度敏感性评价本实验考察了 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 量子点的酸度敏感性。将制备的 PEG-TGA/TGH-CdTe QD 溶液分别置于 pH=5.5、6.8、7.4 的透析液中, 通过测定透析袋中溶液的荧光强度进行表征。结果表明。经 pH=7
14、.4 的缓冲溶液透析, 透析袋内量子点溶液的荧光强度基本不变;而经 pH=6.8 的缓冲溶液透析袋内溶液荧光强度明显降低;当 pH=5.5 时, 透析袋内溶液基本无荧光。这是因为在酸性环境下腙键断裂, 粒径较大的 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 裂解成为小粒径的 TGA/TGH-CdTe QDs 和 PEG, 透过透析袋进入溶液。这一结果与文献结果11一致, 说明本实验制备的 PEG-TGA/TGH-CdTe QD 具有良好的酸度敏感性。2.2 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 与抗体的链接图 1 是不同 CdTe 量子点的荧光光谱图。如图所示, 4 种量子点的荧光光谱峰形保
15、持不变, 发射峰窄而对称。与 TGA/TGH-CdTe QDs 相比, 分别链接 mPEG 醛和兔抗人 CEA 抗体后量子点的荧光强度略微降低, 而同时链接 mPEG 醛和抗体的PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 荧光强度显著增加, 这是因为 TGA/TGH-CdTe QDs由两种稳定剂修饰, 当只链接 mPEG 醛或者抗 CEA 抗体时量子点存在表面缺陷, 影响了量子点的荧光效率。当双稳定剂稳定的量子点同时链接 mPEG 醛和抗 CEA抗体时, mPEG 醛和抗体分别与 TGH 和 TGA 链接, 占据了量子点的表面缺陷和空悬, 对量子点表面起到钝化作用, 使得量子点荧光强度明
16、显提高。荧光光谱证明, 该方法可以将 mPEG 醛和抗 CEA 抗体同时链接于 TGA/TGH-CdTe QDs, 成功构建了双靶向 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs。图 1 CdTe QDs 与抗体和 mPEG 醛链接前后的荧光光谱图 Fluorescence spectra of CdTe QDs before and after being conjugated with PEG aldehyde and antibodies 下载原图2.3 双靶向 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 的结构表征为了进一步验证本实验中 PEG-TGA/TGH-CdTe QD
17、s-Abs 构建方法可行, 将实验室制备的不同 CeTe QDs 进行 TEM 表征 (图 2) 。如图所示, TGA/TGH-CdTe QDs 具有良好的分散性, 为近似球形颗粒, 粒径尺寸分布均匀, 约为 5nm (图 2A) ;链接 PEG 后, PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 形貌未发生明显改变, 但尺寸明显增加, 约为 20nm, 这主要原因是 PEG 长链可以显著增加纳米颗粒的粒径 (图 2B) ;当TGA/TGH-CdTe QDs 链接抗 CEA 抗体后 (图 2C) , TGA/TGH-CdTe QDsAbs 呈现不规则形状, 主要原因是抗体表面存在大量电荷以及氨基活
18、性位点使其可以同时和多个量子点结合并且相互吸引;而当 TGA/TGH-CdTe QDs 同时链接 mPEG 醛和抗CEA 抗体形成 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 后, 长链 PEG 可以利用空间位阻效应阻挡抗 CEA 抗体表面的氨基继续与其他量子点上的羧基结合及相互吸引, 因此形态上近似球形而非不规则形状。由于 TGA/TGH-CdTe QDs 同时链接大分子聚合物 mPEG 醛和生物大分子抗 CEA 抗体, PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 的粒径进一步增加, 约为 50nm (图 2D) 。透射电镜成像结果说明双靶向 PEG-TGA/TGH-CdTe Q
19、Ds-Abs 量子点构建成功。图 2 4 种 CdTe QDs 的 TEM 表征图 TEM imagings of four types of CdTe QDs 下载原图A.TGA/TGH-CdTe QDs;B.PEG-TGA/TGH-CdTe QDs;C.TGA/TGH-CdTe QDs-Abs;D.PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs2.4 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 的 SDS-PAEG 凝胶电泳分析实验对 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs、TGA/TGH-CdTe QDs-Abs、PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 进行了 SDS
20、-PAEG 凝胶电泳分析, 凝胶成像后进行考马斯亮蓝染色, 然后脱色后摄片, 如图 3 所示。凝胶各泳道上样样品由左至右分别为:PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs、TGA/TGH-CdTe QDs-Abs、PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs、抗 CEA 抗体的 PBS 溶液。图 3A 为电泳胶 SDS-PAGE 在紫外灯下成像图, 图 3B 为电泳胶经考马斯亮蓝染色图像。抗体与量子点共价结合形成量子点-抗体偶联物, 由于量子点会发射荧光, 因此经紫外光照射后相应的条带会出现荧光, 而未结合量子点的条带无荧光。如图3A, 除抗体组外其余 3 组均出现荧光条带。链接抗体
21、后偶联物分子量显著增加, 此时样品集中于加样孔一侧。与 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 和 TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 比较, PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 经电泳后发生明显迁移。实验同时通过电泳条带荧光强度考察了不同抗体与量子点比例的影响, 确定抗体用量与量子点的比例为 52 (VV) 。图 3 SDS-PAEG 凝胶电泳图 The SDS-PAGE imaging of QDs conjugates 下载原图A.电泳胶在紫外灯下成像图;B.电泳胶经考马斯亮蓝染色图像 A.The SDS-PAGE imaging under ultra-viole
22、t light;B.The SDS-PAGE imaging being dyed by Coomassie bright blue2.5 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 酸度敏感性在细胞标记中的应用将实验室合成的 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 量子点用于肿瘤细胞 (宫颈癌上皮细胞-HeLa 细胞) 的标记。为考察量子点对于酸度环境的识别能力, 本实验将肿瘤细胞分为两组, 人为设置肿瘤细胞生长微环境, 即细胞培养后弃除原培养基:一组加入 pH=6.5 的培养基 (图 4A、4C) , 另一组加入 pH=7.4 的培养基 (图4B、4D) , 由图 4 可见, PEG-TG
23、A/TGH-CdTe QDs 在 pH=6.5 条件下, 肿瘤细胞出现绿色荧光 (图 4A) , 而在 pH=7.4 的条件下细胞无荧光 (图 4B) 。TGA/TGH-CdTe QDs 在两种 pH 条件下对细胞进行标记, 细胞均出现明显荧光 (图 4C、4D) , 这是因为在细胞标记中, TGA/TGH-CdTe QDs 的粒径极小, 容易被细胞膜吸附吞噬而标记细胞, 呈现荧光。在酸度环境下, PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 腙键发生断裂, 因此易被细胞吸附, 呈现出明显的绿色荧光, 而在中性条件下, PEG-TGA/TGH-CdTe QDs 没有发生改变, 并且 PEG 的链接
24、可以增加量子点的尺寸, 减少细胞对量子点的非特异性吸附, 因此无荧光。2.6 双靶向 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 在细胞标记中的应用将实验室制备的 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 用于宫颈癌 HeLa 细胞标记。通过明场 (图 5A、5B) 和暗场 (图 5C、5D) 中 HeLa 细胞的对比, 表明 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 在微酸性环境 (图 5A、5C) 及中性环境下 (图 5B、5D) 肿瘤细胞均呈现明亮荧光。由于 PEG-TGA/TGH-Ab-CdTe QDs 表面能偶联的抗 CEA 抗体, 可以与 HeLa 细胞表面的
25、 CEA 特异性结合, 实现对 HeLa 细胞的标记, 因此出现绿色荧光。图 4 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs (A 和 B) 及 TGA/TGH-CdTe QDs (C 和 D) 对于HeLa 细胞的标记 Fluorescence labeling of HeLa cells by PEG-TGA/TGH-CdTe QDs (A, B) and TGA/TGH-CdTe QDs (C, D) 下载原图A 和 C:培养基环境 pH=6.5;B 和 D:培养基环境 pH=7.4A and C:the cells culture medium with the pH value of
26、6.5;B and D:the cells culture medium with the pH value of 7.4图 5 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 对于 HeLa 细胞的标记 Fluorescence labeling of HeLa cells by PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 下载原图A 和 C:培养基环境 pH=6.5;B 和 D:培养基环境 pH=7.4A and C:the cells culture medium with the pH value of 6.5;B and D:the cells culture medium
27、with the pH value of 7.43 结论本实验经化学方法制备 PEG-TGA/TGH-CdTe QDs-Abs 量子点, 通过在 TGA/TGH-CdTe QDs 的表面同时链接 mPEG 和 Abs, 使其具有双靶向功能。表面增加的酰腙键可实现对肿瘤细胞或组织微环境的特异性识别, 并减少细胞或组织表面对量子点的非特异性吸附, 抗体的链接可以实现肿瘤的免疫识别。本量子点实现了对肿瘤细胞的微环境和免疫识别双重功能, 具有良好的后期应用价值。参考文献1Zhang J, Jia X, Lv XJ, Deng Y L, Xie H Y.Fluorescent quantum dot-l
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