1、高效液相色谱分析,LOGO,基本概念与特点,概念：高效液相色谱法(HPLC)是在20世纪60年代末，以经典液相色谱为基础，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高效固定相、高压输液系统和高灵敏度的在线检测器，从而发展起来的一种新型分离分析技术。随着科学和技术的不断改进与发展，目前已成为应用极为重要、广泛的分离分析手段. 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动化。,2,液相色谱流程与原理,基本原理：混合组分的样品在色谱柱中，各组分由于在流动相和固定相之间溶解、吸附、渗透或离子交换等作用力的不同，随流动相在色谱柱中运行时，在两相间进行反复多次分配过程，使得原来分配系数具有微小区别的各组分
2、，产生了保留能力明显差异的效果，进而各组分在柱中的移动速度不同，经过一定长度的色谱柱，彼此分离开来，最后按一定顺序流出。,3,色谱图及相关名词,（一）色谱流出曲线色谱图 色谱图是色谱柱流出物通过检测器所产生的响应信号对时间或液体流出体积的曲线 。 色谱流出曲线是色谱基本参数的源流，而色谱基本参数又是用来观察色谱行为和研究色谱理论的重要指标。另外，还可以直接利用色谱图峰位置点（特征保留值）进行定性，根据曲线上测得的峰高或峰面积进行定量。,4,（二）柱效能 色谱柱在色谱分离中由动力学因素所决定的柱效能，通常用塔板高度或塔板数表示。 塔板数： 塔板高度：,5,涡流扩散相,分子扩散相,流动相线速度,传
3、质阻力相,（三）分离度R,6,分离度的表达式：,tR(2), tR(1): 组分2和组分1的保留时间,Wb(2), Wb(1): 组分2和组分1的峰底宽度,7,R=1.5 完全分离,高效液相色谱系统,（一） 高效液相色谱仪结构流程,8,高压泵,色谱柱,废液,检测器,进样器,储液瓶,高压输液泵、高效分离柱、高灵敏度检测器,（二） 高压输液系统（高压泵）,高压输液泵是核心部件，要求：密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等。 高压泵主要有恒流泵（往复泵）和恒压泵（气动泵）两种。 恒流泵特点输出流量保持恒定而与色谱柱引起阻力变化无关。分为机械注射泵和机械往复泵(常用)
4、两种。 恒压泵特点能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。,9,10,图10-7 柱塞往复泵示意图,（三）色谱柱,色谱柱是高效液相色谱分离过程的核心。一支稳定、高效的色谱柱对建立适用性强、重现性好的分析方法是必不可少的。 1.担体 高效液相色谱的柱填料有离子交换树脂、凝胶，较多的使用硅胶微粒作为担体。以下为几种常用的微粒类型： (1) 全多孔型担体：属于颗粒均匀的多孔球体，很好的兼顾了效能、样品荷载量、耐久性等理想的性质，所以最为常用。 (2) 表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）： 它是直径为 30 40 m 的实心核 ( 玻璃微珠 ) ，优点是：孔穴浅（固定相
5、仅为表面的一薄层），传质速度快，易于填充均匀，柱效高。这种担体目前应用较为普遍。,11,2.色谱柱,柱体为直型不锈钢管，标准内经为4.6或3.9 mm，柱长1530 cm，填料颗粒粒度510m。发展趋势是减小填料粒度(35m)和柱经以提高柱效。,12,为保护色谱柱， 通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。,3.固定相,选择固定相的一般标准还是以“相似相容”原理为基础。 如果溶质溶于烃类溶剂，表明是低极性化合物，这样就可以选择非极性或亚极性固定相。 若样品溶于极性温和溶剂中，如醇类，则可选择极性固定相，也可以选择非极性固定相。,13,4.流动相,14,液相色谱的流动相又称为淋洗液，洗脱剂。流
6、动相组成、极性改变，可显著改变组分分离状况，改变流动相的组成和极性（组成比例）是提高分离度的有效手段。,常用溶剂： 环己烷、己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、甲醇 、乙腈、水等。,15,正相液相色谱 （正相柱）,反相液相色谱 （反相柱）,组分极性越大，保留时间越长；使用极性化合物的分离。,组分极性越小，保留时间越长；适用非极性化合物的分离。,16,选择流动相时应注意的问题,1、尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,2、避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,17,3、试样在流动相中应有适宜的溶解
7、度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,4、流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,（四）检测器,（一）、紫外检测器应用最广泛的检测器,18,基本原理：试样组分对特定波长的紫外光具有选择性的吸收，吸光度与试样组分浓度之间的定量关系符合郎伯-比耳定律。,优点： 灵敏度高，线形范围宽； 死体积小； 波长可选； 对流速和温度变化不 敏感； 可用于梯度洗脱。,缺点： 无紫外-可见吸收组分不响应； 流动相选择受一定限制。,19,(a) 可变波长紫外检测器,(b) 二极管阵列检测器,（二）、示差折光检测器通用型检测器,20,每种物质具有不同的折光指数。,基本原理：连续检测参比池
8、和样品池中流动相之间的折光系数差值，该值与试样池流动相中的组分浓度成正比。,生命科学中各类糖类化合物，没有紫外吸收，一般要用示差折光检测器。,21,缺点： 灵敏度低； 对温度敏感； 不能用于梯度洗脱。,（三）、荧光检测器专用型检测器,22,基本原理：在一定的条件下，荧光强度与流动相中的组分的浓度成之比。,对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,23,特点： 高灵敏度； 高选择性； 可用于梯度洗脱。,定性与定量,（一）样品预处理 1.固体样品 固体样品首先要进行均质化，然后再采用如蒸馏、超临界萃取或超声波萃取等技术进行样品制备。 2.液体样品 （二）定性与定量 参阅气相色谱的定性与定量方法。,24,液-液萃取,固相萃取,凝胶过滤色谱,气相色谱与高效液相色谱的比较,25,作者：应姗姗,
