1、生化制品技术实验大纲一、实验目的本实验是生化制品技术课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。二、适用专业及层次适用于生物制药技术专业学生三、实验内容和学时分配序号实验内容学时实验类型必做/选做备注1牛奶中酪蛋百和乳蛋白素粗品的制备4操作实验必做2卵磷脂的制备及鉴定4操作实验必做3薄层板制备及使用4操作实验必做4甘露醇的制备及鉴定4操作实验必做5甲壳素制备4操作实验必做合计20实验一 牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备一、实验目的1.掌握盐析法的原理和操作。2.掌握等电点沉淀法的原理
2、和基本操作。二、实验原理乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。三、实验器材烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水
3、浴锅。四、试剂和材料脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。五、操作步骤1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白（1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40水浴中加热并搅拌。（2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40，再在搅拌下慢慢地加入50ml40左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。（3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去
4、乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。2.等电点沉淀法制备乳蛋白素（1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至30.1。（2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。（3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.59.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。（4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。（5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边
5、搅拌，一边利用pH计以0.1mlo/L盐酸调整pH至30.1。（6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。六、结果与讨论1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相比较。求出实际获得率（%）。2.计算出100ml牛乳所制备出的乳蛋白素数量。实验二 卵磷脂的制备及鉴定一、实验目的学习从蛋黄中制备卵磷脂的方法和基本操作。二、实验原理利用卵磷脂可溶于乙醇的性质，将卵黄溶于乙醇，卵磷脂从卵黄中转移到乙醇溶液中，可分离提取出来，而蛋白质等某些杂质从沉淀物中除去。但由于乙醇溶剂抽提时，其他物质也一起被抽提，如甘油三脂、甾醇等。利用卵磷
6、脂不溶于丙酮的性质，用丙酮从粗卵磷脂溶液中沉淀磷脂，能使卵磷脂与其他脂质和胆固醇分离开来。无机盐和卵磷脂可生产络合物沉淀，因此可利用金属盐沉淀剂将卵磷脂从溶液中分离出来，由此除去蛋白质、脂肪等杂质，再用适当溶剂萃取出无机盐和其他磷脂杂质，这样可大大提高卵磷脂纯度。三、实验器材离心机、旋转蒸发仪、布式漏斗、抽滤瓶、真空干燥箱、层析缸、紫外分光光度计。四、试剂和材料95%乙醇、丙酮、10%ZnCl2、2%氯仿、碘、甲醇、0.1%乙醇、无水乙醇。五、操作步骤1、粗提室温下，取适量的鸡蛋卵黄用2倍于卵黄体积的95%乙醇进行提取，混合搅拌，离心分离（3000r/min，5min），将沉淀物重复提取3次，
7、回收上清夜；然后减压蒸馏（45）至近干，用少量石油醚洗下粘壁的黄色油状物质；加入丙酮，抽滤，分离出沉淀物，真空干燥（40，30min），得到淡黄色的粗卵磷脂，称重。2、精制取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10%的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10%的ZnCl2水溶液，室温搅拌0.5h；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4）洗涤，搅拌1h，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无色止，得到白色蜡状的精卵磷脂；干燥；称重。3、鉴定（1）薄层色谱分析 将卵磷脂样品与对照品分别配成2%氯仿溶液，用GF254硅胶板进行层析，展开剂为氯仿甲醇水（65254），层析完毕后，取出薄板，干燥，碘蒸汽显色。
8、（2）紫外吸收光谱测定 将一定量卵磷脂样品溶于无水乙醇，配成0.1%乙醇溶液，用紫外分光光度计扫描其在90400nm的吸收光谱，可测得卵磷脂的紫外最大吸收峰。卵磷脂紫外最大吸收峰在215nm波长。六、结果与讨论1.计算卵磷脂得率，讨论影响卵磷脂得率的主要因素。2.根据薄层色谱图谱、紫外吸收光谱分析所制备的卵磷脂的纯度。实验三 薄层板的制备及使用实验一 薄层色谱板的制备和使用目的要求：通过实验进一步理解薄层色谱技术理论，熟悉掌握薄层色谱板的制备和使用方法。一、薄层层析的基本原理把吸附剂（固定相）均匀地铺在一块玻璃板上，将待分离的样品溶液点加在一薄层板的一端，在密闭的容器中用适当的溶剂（流动相）展
9、开，由于吸附剂对不同物质的吸附力大小不同及溶剂对不同物质溶解分配系数不同，当溶剂流过时，各物质在吸附剂和溶剂之间发生连续不断地吸附，解吸附，再吸附，再解吸附。不易被吸附或易被溶剂溶解的物质相对移动得快一些。经过一段时间的展开，不同的物质被彼此分开，最后形成相互分离的斑点。将展开完毕的薄层板从密闭容器中取出后，应用特定的试药或方法将斑点显色，从而达到定性和定量的目的。二、薄层板的制备1玻璃板用一块玻璃板涂上很薄的吸附剂，如硅胶或氧化铝等，玻璃板要求薄厚一致，大小相同，表面光滑平整，一般玻璃只要合乎这些要求就可。如果找不到平整均一的，将旧光学照像底片截成同样大小也可以。用前先将玻璃用肥皂和水洗干净
10、，必要时浸泡在清洗液中，然后水洗烤干，用纱布擦光。玻璃板大小有各种规格，一般有2020、2010、205厘米，也有更小的，可根据需要自行设计。宽度要求至少能点开两三个样品，每两点之间相隔至少1.5厘米，玻板长度一般要满足展开10厘米的距离。点样的起点应距底边至少1.5厘米的距离。2吸附剂应用最广泛的为硅胶和氧化铝，市场上有专供薄层色谱用的吸附剂，规格分不含粘合剂的硅胶H，氧化铝H和含有粘合剂熟石膏的硅胶G，氧化铝G，如市售硅胶G含13熟石膏，氧化铝分中性、酸性、碱性三种。吸附剂的粒度范围最好在180200目之间，太小了流速慢，太大则影响分离效果。如不合要求，应过筛。3薄层板的涂布最简单的涂布方
11、法是用两条比玻璃板厚025毫米的玻璃条或有机玻璃条（或在同样厚度的玻璃条下粘一层胶布），将玻璃板夹住，把调好的吸附剂浆液平铺在薄层板上，然后用一有机玻璃条或直尺，迅速均匀地向前推进，就象推血片一样，只要推进的速度均匀一致，即可得到薄厚均匀的薄层板，如在一块玻璃板末端再接一块相同的玻璃板，把剩余的装液接过去，可使涂层边缘整齐，厚度一致，吸附剂浆液的加水量和搅拌时间是涂布成败的关键，像128平方厘米的玻璃板需要23克硅胶G，加46毫升水即可，只要技术熟练即能涂成厚薄一致，光滑平整的一块薄层板。不同性质不同批号的吸附剂，加水量和搅拌时间有时可有差异，应根据情况摸出规律。为了达到涂布的各板厚度均匀一致
12、，最好采用涂布器进行薄层的涂布。为了增加薄层的牢固性及易于保存，可在涂布过程中加入某些粘合剂以增加薄层的硬度。一般采用添加剂羧甲基纤维素钠（CMCNa），应用方法是取CMC-Na 1克溶于100毫升水中，加热煮沸溶解，按比例与硅胶搅匀，铺板。涂成之后先把玻板放在平面上，室内干固，再对光检查，看是不是均匀，有无气泡，平整光洁度如何，合格的上烤箱110加热30分钟进行活化，冷却后贮于干燥器内备用。在进行实验时，应尽量可能采用同批号涂布活化的薄层板，以减少因活化不一致引起的Rf值发生差异，目前国内市场已有成品供应，如黄岩化学分析材料厂即有各种类型的薄层板出售。三、薄层板的使用1点样将样品溶于适当的溶
13、剂中（应尽量避免有水），取微量注射器或玻璃毛细管截齐后，吸取一定量的检样，轻轻接触到薄层上，使样品自动吸到薄层上，点的直径不要超过0.3厘米，一次不能点完，待干后再点，稍有过分就会损伤板面，影响展开后的斑点形状。每两个样点之间相距至少1.5厘米。点样的起点距薄板底边至少1.5厘米，以免样点浸入展开溶剂中，同块薄板上各样点应保持在与底边平行的一条直线上，为控制好点样距离，应用薄层点样尺架。2展开根据薄层板大小，自行选用适当玻璃标本缸，长方形，如17106厘米的标本缸可容纳下159厘米的玻璃板。采用较大的玻璃缸和玻璃板时，在缸内沿周围缸壁衬一层预先浸有溶剂的滤纸，以便缸内展开溶剂易达到饱和，防止边
14、缘效应（即两边缘的点走得快）和同一物质Rf值不一致现象。一般将薄层板斜置展开容器内，密闭。先不使溶剂浸湿薄层板，饱和1015分钟后再进行展开，展开溶剂沿着薄层板向上移动。对加粘合剂的涂板可以近于垂直的状态进行展开，而对未加粘合剂的薄层板则必须以倾斜状态（15度角）进行展开。为了防止产生“边缘效应”和展开溶剂不饱和现象。还可采用夹心式展开容器，其方法是将薄层板的左右两侧各刮去510毫米，垫上条状玻璃或塑料，盖一块与薄层板同样大小的玻璃，用夹子将两边夹好，插入展开溶剂中进行展开，并能取得良好效果。3显色薄层展开后，凉干。如含粘合剂，即可直接喷显色剂，使之显色，有的还需经紫外线（254nm）照射后方
15、能显色；对不含粘合剂的薄板，在喷显色剂时应尽量远离薄层板，否则会连吸附剂一起吹掉，应予以注意。四、检样的定性定量分析1比移值（Rf）的测定当样品的薄板一端被展开，经过毛细管作用流向另一端，样品是按一定的比例分配在固定相与流动相之间。并沿着溶剂流动的方向移动，由于样品中各组分在两相中分配系数不同，各组分的移动速度也不同，经一定距离后使各组分彼此分离。样品各组分移动的速率，亦即分离后在薄层板上的位置与溶剂展开前沿的距离的比值为比移植。2定性分析相同的物质Rf值应当是相同的，但因能影响Rf值的因素很多，要想得到与标准物质相同的Rf值，最好在鉴定时，将样品与标准物质点在同一张薄层板上一同展开，根据检样
16、斑点的Rf值与标准样品的Rf值比较，即可确定二者是否相同，但要做到准确的定性，需要两种以上展开溶剂系统所得的Rf值比较判断。3定量分析（1）目测比较法用吸附剂（如硅胶G）涂布成厚0.250.5毫米，大小2020厘米的薄层板，110活化30分钟，室温冷却。用微量注射器（10微升）在距板底1.5厘米处，将标准样品溶液按1、3、5、7微克自左向右点在起始线上，然后再吸取不同量的检材提取溶液（相同于1、3、5克检材的提取溶液）按次序点在同一板的右侧。选择比移值适中的展开剂（Rf在0.450.75之间者）用夹心式展开法或连续薄层展开法。展开距离为10厘米，显色剂要求能使显色后的斑点明显清晰。这样得到的色
17、斑比较集中，重现性好，便于比较。显色后，观察其色斑大小，深浅与已知不同浓度的标准样品系列色斑相比较，粗略定出含量，然后算出检液总体中含量，根据所取检材量，求出百分含量。（2）洗脱测定法在制备好的薄层板左端，先点一标准样品点，作为对照定位用，然后根据检材提取溶液的多少，在同一板的右端点成点状或线状。置玻璃缸中展开（如有连续薄层展开仪更好），展开后晾干，再用玻璃板遮住右侧检材部分，仅使对照定位点显色。显色后，根据斑点位置将未显色部分（相当于色斑所在部分）的吸附剂用刮刀刮下或用抽吸法收集起来。将收集的吸附剂置于小层析柱管中，用极性大的溶剂甲醇或乙醇进行洗脱，收集洗脱液并加以浓缩。用适当溶剂调整到一定
18、体积，可用紫外分光光度计，在被检物最大吸收波长处进行测定。同时用薄层吸附剂洗脱液作空白吸收值测定。如有灵敏度高专属性好的比色反应，还可用比色计测定化合物的含量。上述洗脱液亦可作为气相色谱仪、液相色谱仪分析前的处理液。（3）薄层色谱扫描仪测量法以洗脱法处理层析色斑，不仅操作麻烦，而且有些待测成分不能定量地洗脱下来。或者在洗脱过程中发生分解，影响测定结果的准确性，最好是采用双波长薄层色谱扫描仪直接定量检测，经电子积分器积分推算出检样中待测物质的含量。其测定方法包括为：斑点面积测量法；斑点光密度测量法；斑点荧光测量法。附：实验仪器1薄层涂布器 2微量注射器 3薄层点样尺架4薄层板展开缸 5吸引器 6
19、喷瓶7烘烤箱实验四 甘露醇的制备及鉴定一、实验目的1.了解甘露醇的化学和物理特性。2.掌握从海带中分离提纯甘露醇的原理和操作方法。二、实验原理甘露醇为白色针状晶体，无臭，略有甜味，不潮解。易溶于水，溶于热乙醇，微溶于低级醇类和低级胺类，微溶于吡啶，不溶于有机溶剂。在无菌溶液中较稳定，不易被空气所氧化，熔点166。甘露醇在海藻、海带中含量较高。海藻洗涤液和海带洗涤液中甘露醇的含量分别为2%与1.5%，是提取甘露醇的重要资源。本实验以海带为原料，用自来水浸泡提取甘露醇；通过调节酸度，沉淀除杂质；煮沸浓缩后用乙醇沉淀甘露醇；最后通过回流、重结晶、活性炭脱色等工艺精制甘露醇。三、实验器材pH试纸、电炉
20、、布式漏斗、抽滤瓶、回流装置。四、试剂和材料海带（市售）、30%NaOH、硫酸-水（11）、95%乙醇、粉末活性炭、1mol/L三氯化铁溶液、1mol/LNaOH溶液。五、操作步骤（1）浸泡、碱化、酸化 将海藻或海带加20倍量自来水，室温浸泡23h，浸泡液用作第二批原料的提取液，一般浸泡4批后浸泡液中的甘露醇含量已较大。收集浸泡液用30%NaOH，调pH1011，静置8h，凝集沉淀多糖类黏性物，待海藻液、淀粉及其他有机黏性物充分凝聚沉淀。虹吸上清液，用11H2SO4-H2O中和至pH67，进一步除去胶状物，得中性提取液。（2）浓缩，醇洗 直接用火或蒸汽加热至沸腾蒸发，温度110150，大量氯化
21、钠沉淀，不断将盐类与胶污物捞出，直至呈浓缩液，取小样倒于玻璃板上，稍冷却至室温后，离心甩干除去胶质，得灰白松散物。（3）提取 取松散物，加入8倍量的95%乙醇加热回流30min，静置一昼夜，2500r/min离心甩干，得白色松散甘露醇粗品，同上操作，乙醇重结晶1次。（4）精制 甘露醇粗品加适量蒸馏水，加热溶解，再按5%质量加入粉末活性炭，不断搅拌，加热至沸腾，趁热过滤，少许水洗活性炭2次，合并洗滤液（如有浑浊重新过滤），高温浓缩至浓缩液相对密度为1.2左右时，在搅拌下冷却至室温，低温结晶，抽滤至干，得到结晶甘露醇，烘干得甘露醇成品。（5）鉴定 取所制得的甘露醇成品饱和溶液1ml，加1mol/L
22、三氯化铁溶液与1mol/LNaOH溶液各0.5ml，即生成棕黄色沉淀，振摇不消失，滴加过量的1mol/LNaOH溶液，即溶解成棕色溶液。符合此现象，可初步断定为甘露醇。六、结果与讨论1.称重，计算甘露醇的得率。2.讨论影响甘露醇的得率因素。实验五 甲壳素制备一、实验目的1、掌握以虾壳或蟹壳为原料，用酸碱法制备甲壳素；用制备好的甲壳素脱乙酰化制备壳聚糖。2、了解甲壳素与壳聚糖的应用，黏度计的使用。二、实验原理甲壳素广泛存在于虾、蟹、昆虫等甲壳动物的外壳。甲壳素一般与蛋白质或碳酸钙或两者同时紧密结合在一起，成为络合物，通过酸碱处理可除去钙盐及蛋白质等杂质，虾、蟹壳还有色素，可以通过氧化还原除去。甲
23、壳素是聚-2-乙酰胺基-2-脱氧-D-吡喃葡糖，是一种线形中性高分子多糖，经浓碱处理去掉乙酰基得到脱乙酰甲壳素，即壳聚糖。三、仪器设备烘箱、水浴锅、天平等。四、相关知识点多课程知识点：多糖化学特点，生化提取方法：蛋白质分解方法，碳酸盐降解方法，有机化学知识：酰胺基脱酰基方法。五、实验方法从蟹壳中提取甲壳素的生产工艺洗净蟹壳，取50g, 15%的氢氧化钠溶液中煮沸2小时，清水洗至中性。放入体积分数为12%的盐酸溶液中浸泡脱钙，至溶液中无气泡产生为止，再继续浸泡1小时，得沉淀物。沉淀物水洗至中性，干燥。用30%的双氧水脱色1小时。105 烘箱恒温烘干4小时。得白色固体，即为甲壳素,计算收率方法一1
24、. 洗净蟹壳50g，用5%-6%的HCl在室温20下浸泡24小时，不断搅拌以充分除去钙质，得沉淀物。2. 沉淀物水洗3次，清洗后的沉淀物用3%-4%NaOH煮沸4-6小时以除去蛋白质，得沉淀物。3. 将沉淀物水洗3次，清洗后的沉淀物用0.5%的高锰酸钾处理1小时。得沉淀物。4. 沉淀用1%的硝酸在60-70下浸泡30-40分钟，得白色产品。5. 水洗，干燥，得甲壳质工业品。6. 甲壳质的收率为蟹壳的15%、虾壳的20%。方法二1. 称取蟹壳50g，在室温下浸泡于1.0mol/L的盐酸中24小时，不断搅拌以充分除去钙质，得沉淀物。2. 沉淀物用水洗涤至中性，在室温下浸泡于2.5mol/L的氢氧化钠溶液中24小时，得沉淀物。3. 将沉淀物水洗3次，清洗后的沉淀物浸泡于1.0mol/L的盐酸中24小时，得沉淀物。 4. 沉淀物用水洗涤至中性，105 烘箱恒温烘干4小时。得白色固体，即为甲壳素。方法三1. 称取蟹壳50g，放入质量分数为15%的氢氧化钠溶液中煮沸2小时，用清水漂洗多次至中性。2. 放入体积分数为12%的盐酸溶液中浸泡脱钙，至溶液中无气泡产生为止，再继续浸泡1小时，得沉淀物。3. 沉淀物水洗至中性，干燥。用30%的双氧水脱色1小时， 105 烘箱恒温烘干4小时。得白色固体，即为甲壳素。六、思考题甲壳素是否容于水，有何应用？
