1、 毕 业 论 文（设计）题 目：海南花梨木 DNA 条形码序列测定 学 号： 姓 名： 年 级： 学 院： 系 别： 专 业： 指导教师： 完成日期： 海南花梨木 DNA 条形码序列测定摘 要DNA 条形码作为生命体所固有的遗传物质，客观存在于细胞内的物质，不受人为因素干扰，能准确的反映出物种最基本的信息。为了验证国际生命条形码联盟推荐的 MatK，trnH-psbA，ITS2 三个候选条形码，在珍贵木材降香黄檀(Dalbergia odorifera T. Chen)又名花梨木DNA 条形码测定中的有效性。从基地采摘的降香黄檀叶片中提取 DNA，用特异性引物进行 PCR 扩增，得到三条候选条
2、形码的目的片段，扩增成功的 DNA 片段可用于进一步测序分析。以 PCR 扩增成功率和测序成功率初步评价候选 DNA 条形码片段，评选出最优的条形码片段，为今后利用DNA 条形码鉴定木材和构建木材分子条形码数据库提供理论依据。实验结果：只有 ITS2 的条形码片段测序成功，得到对应的序列。通过 NCBI 查询黄檀属其他物种的 ITS2 序列，得到：降香黄檀的 ITS2 分子序列与黄檀属植物均不同，其中与越南黄檀差异最小，其次是多裂黄檀。多重比对后构建该序列的进化树结果说明降香黄檀与越南黄檀、多裂黄檀有着较近的亲缘关系，但又不属于同一植物类群，且三者有着稳定的遗传差异性。建议把 ITS2 序列作
3、为鉴定降香黄檀的候选条形码序列。关键词：降香黄檀；DNA 条形码；ITS2；分子鉴定降香黄檀 DNA 条形码序列测定IIAbstractDNA barcode as the genetic materialin life inherent that objectively existed in the cell, without artificial interference. It could accurately reflect the most essential information for species. In order to verify three candidate ba
4、rcodes of the MatK, trnH psbA and ITS2 recommended by CBOL and the effectiveness in Dalbergia odorifera s DNA barcode. Extracted DNA of its leaves from the base,using specific primers for PCR amplication. The purpose of the three candidates from bar code fragments were obtained and the targeted segm
5、ent was amplified successfully to be used for sequencing analysis. PCR amplification and sequencing success rate could be used for the preliminary evaluation the bar code fragments of candidate DNA ,Selected the best bar code fragment,which provided theoretical basis for using DNA identification of
6、wood and wood construction molecule.The results were as follows : only ITS2 coded fragment was successfully sequenced. and the corresponding sequence was gained. By searched ITS2 of other species which belong to Dalbergia from NCBI. We got the consion conclusion that: ITS2 of Dalbergia odorifera wer
7、e different,with Dalbergia tonkinensis minimum, followed by Dalbergia rimosa Multiple comparison after building the sequence of the evolutionary tree result showed that Dalbergia odorifera Dalbergia tonkinensis and Dalbergia rimosa had the close relationship. Though they are not belong to the same g
8、roup of plants, and they have a stable genetic diversity. So ITS2 sequence can be uesd to identified candidate barcode of Dalbergia.Keywords:Dalbergia odorifera T.Chen; DNA barcoding; ITS2; molecular identification降香黄檀 DNA 条形码序列测定II目 录1 前言 .11.1 分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展 .11.2 研究的目的与意义 .22 材料与方法 .32.1
9、 材料 .32.2 试剂药品 .32.3 主要仪器设备 .32.4 实验步骤 .32.4.1 条形码片段的 PCR 扩增 .32.4.2 条形码片段的纯化与检测 .52.4.3 克隆 .62.4.4 测序 .73 结果与分析 .73.1 条形码片段 PCR 扩增结果 .73.2 条形码片段测序结果 .83.3 序列分析 .104 结论与讨论 .114.1 结论 .114.2 讨论 .11致谢 .13参考文献 .14降香黄檀 DNA 条形码序列测定001 前言降香黄檀(Dalbergia odorifera T. Chen.)又名花梨木为黄檀属植物 ,异花授粉，翅果，主要靠种子繁殖。以其枝干、根
10、、心材干燥后入药，具行气活血、止血、止痢功效，是国家药典收载名贵南药之一。现代研究还发现降香黄檀具有抗氧化 1、抑制中枢 2等的作用 3。降香黄檀心材极耐腐，切面光亮，且香气经久不灭，可用于高档家具、工艺品等。野生的降香黄檀大多分布于我国海南省中部和南部，且多生于中海拔地区 4，一般成片生长，形成了以降香黄檀为上层树种的植物群落类型 5。品种的种质背景复杂和由各居群所处地理位置不同而产生的水热条件差异，都是降香黄檀具有丰富遗传多样性的影响因素。降香黄檀生长较为缓慢，从种植到心材出现需要多年的时间，近年来其野生资源已遭毁灭性的破坏，濒于灭绝急需保护 6。研究表明，降香黄檀表现较高的遗传多样性，且
11、其适应环境能力强，因此导致其濒危的主要原因可能是其极高的药用价值和工艺价值越来越得到人们重视，导致用量急剧增大，人为乱采滥挖所至 7。原有文献记载的有野生分布点区域，现已很难再找到该植物，比如 2004 年在三亚的南山附近零星有分布降香黄檀小树,到 2006 年时，该处已无降香黄檀。现在降香黄檀只有在少数的保护区有少量分布，及部分植物园引种、收集保存和农民种植所保留下来的，数量十分有限 8。为保护降香黄檀种质资源和遗传多样性,不只需要宣传保护意识，还要大量地收集现有的降香黄檀种群的种质资源，并加强管理措施，保持其种群中丰富的遗传多样性。采取就地保护、繁殖，遗传性高且面积较小的群体 9。相关的职
12、能部门应加大对偷采滥伐的监管力度，尽量保护每株野生降香黄檀种质资源；全力开展对降香黄檀种质保存及扩大繁殖的研究,扩大居群规模；同时通过高新技术的应用，建立核心种质库的方式提高种质资源管理的质量和效率 10。1.1 分子条形码序列测定及其在木材应用方面的研究进展分子条形码作为生命体所固有的遗传物质，通过 DNA 水平鉴定技术已成熟地应用于动植物的鉴定 11-12。作为客观存在于细胞内的物质，不受人为因素干扰，能更客观且准确的反映出物种的最基本信息 13。降香黄檀 DNA 条形码序列测定11分子条形码技术的主要应用于筛选出适合的 DNA 片段，它的黄金时代开始于 2003 年。现在已成立的生命条形
13、码联盟 CBOL，一个国际自发组织的联盟，在于支持 DNA 条形码的发展，旨在促进全球的标准化以及相应的 DNA 条形码研究。分子条形码技术研究的领域集中于针对具体的科属，针对性地筛选合适的 DNA 条形码。它利用一段标准的 DNA 片段区域作为物种标识，进而快速准确地进行物种鉴定 14。理想的 DNA 条形码应当满足：有变异性、丰富的系统进化学信息、标准化、片段短、稳定易获取 5 个标准 15。在查看参考文献后从众多研究成果中，选择matK，trnH-psbA，ITS2 三条国际生命条形码联盟所推荐的候选片段应用于本次研究 19。matK 片段长度约为 1500bp，位于叶绿体基因内含子内，
14、是叶绿体DNA 编码区进化速度最快的片段之一，编码一种参与转录 RNA 内含子剪切的成熟酶 20。其在种内种间变异，种内种间差异较大可以作为所研究的天南星科、柑橘以及近缘植物、姜科砂仁属植物植物 DNA 条形码分类条形码 21。trnH-psbA 片段长度为 318-322bp，是叶绿体间隔区进化速度最快的片段之一。该片段在很多研究中表现出很好的物种鉴定效果比如洋金花及其混伪；也可以鉴定山麦冬及其近缘种；在桉属可用于潜在的条形码鉴定研究 22。ITS2 片段长度为 500-750bp,是核糖 DNA 的内转录间隔区，为主要应用于系统发生学标记的片段之一。由于该片段进化速度快，被很多的国内外学者
15、所重视，协和医院陈士林科研组在研究了大量的植物样本后提议把ITS2 片段作为药用植物 DNA 条形码 23。科学家发现豆蔻属药用植物、葫芦科和景天属药用植物等等都发现 ITS2 序列可以作为所研究对象的 DNA条形码 24。如今 ITS2 序列已成立了独立的数据库，数据正不断地在扩充。根据其二级结构保守性，科学家可以通过软件预测出 ITS2 的二级结构，比较其结构的差异同样可以完成鉴定工作 25。1.2 研究的目的与意义降香黄檀野生资源已被大量破坏，濒临灭绝，但因其药用和商业价值降香黄檀 DNA 条形码序列测定22很高 26，所以部分不良商贩受利益驱使，用黄檀属其他树种冒充降香黄檀进行销售，因
16、它们密度、材色以及构造与降香黄檀极非常相似 27，专业技术人员用传统的识别方法很难鉴定，普通消费者更是无法区分和识别，这给消费者造成了巨大的经济损失，也给林业检查和海关人员的识别工作增加了难度 28。在本次研究中，为了验证国际生命条形码联盟推荐的 MatK，trnH-psbA， ITS2 三个候选条形码对降香黄檀分子条形码测定的有效性，用特异性引物对降香黄檀 DNA 进行 PCR 扩增，扩增成功的 DNA 片段用于进一步测序分析，测序成功的条形码片段可用于降香黄檀的研究鉴定。以 PCR 扩增成功率和测序成功率初步评价候选 DNA 条形码片段，为今后利用 DNA 条形码鉴定木材和构建木材分子条形
17、码数据库提供理论依据。2 材料与方法2.1 材料基地种植的降香黄檀，采摘树叶提取的 DNA 作为实验模板。2.2 试剂药品琼脂糖，TAE ，Goldview,TaKaRa Ex Taq，610 Loading Buffer，dNTP Mixture ，灭菌 ddH2O，AL2000 MarKer。2.3 主要仪器设备 电子天平；量筒；烧杯；PCR 仪；凝胶成像系统；高速冷冻离心机；低温冰箱；移液枪（eppendprf：2.5L；10L ；20L ；50L；100L）；移液管；微波炉；紫外分光光度计（NanoDrop ND-1000）；涡旋仪（IKA）；恒温摇床；电泳仪、电泳槽；恒温水浴锅；恒温
18、培养箱；超净工作台；手掌型离心机。2.4 实验步骤2.4.1 条形码片段的 PCR 扩增（1）扩增引物降香黄檀 DNA 条形码序列测定33特异性的 PCR 扩增也同样要求引物的特异性，产物的特异性程度依赖于扩增引物和模板的互补程度。在本次研究中采用的引物长度为 20 至23，GC 的含量为 40%-60%，且没有连续排列的 5 个碱基 29。引物名称和序列见表 1。表 1 候选条形码片段的扩增引物Table1. Primers for each candidate barcoding sequences amplification扩增片段Target segments引物名称Primer na
19、me引物序列 5-3Primer sequence 5-3M1 CGATCTATTCATTCAATATTTC(22)MatKM2 TCTAGCACACGAAAGTCGAAGT(22)T1 GTTATGCATGAACGTAATGCTC(22)trnH-psbAT2 CGCGCATGGTGGATTCACAATCC(23)I1 ATGCCTCAATCCAGAGAGACCC(22)ITS2、I2 TAGCCCCGCCTGACCTGAG(19)（2） PCR 反应体系采用 25L 反应体系，各反应成分：0.12L TaKaRa Ex Taq，2.5L 610 Lodaing Buffer，2L dNTP
20、 Mixture，1L 上游引物，1L 下游引物，1L DNA 模板，加入 17L 灭菌 ddH2O 至总体系 25L。（3）PCR 反应条件降香黄檀 DNA 条形码序列测定44表 2 候选条形码片段的 PCR 反应条件Table2.PCR conditions for candidate barcoding sequences扩增片段 PCR 反应条件MatK94 4min ，94 1 min，48 1 min，72 1 min，30 cycles72 7 mintrnH-psbA94 1 min，94C 1 min,61.145s， 72 1 min，30 cycles72 7 minIT
21、S294 4 min94 1 min，56.4 1 min，72 1min，30 cycles72 7 min配置 25L 反应体系，用 0.5%的琼脂糖凝胶电泳检测样本 DNA，左边第一孔用移液枪注入 5L AL2000 做对照。取 1L 610 Lod aing Buffer，5L 样本 DNA 混合点样于胶孔中。设置电泳仪U=120V，I=220mA，25 分钟后取出凝胶置于凝胶成像系统中紫外灯源下观察 PCR 产物条带。2.4.2 条形码片段的纯化与检测（1）条形码片段的纯化采用天根柱式核酸纯化试剂盒纯化 PCR 产物（根据电泳检测结果灵活确定待纯化条形码片段的 PCR 量）。 在紫外
22、灯源下，用锋利的手术刀片将单一的目的条形码 PCR 产物条带切下，置于灭菌离心管中，并称重。取 500L 平衡液 BL 活化 CA2 吸附柱。降香黄檀 DNA 条形码序列测定55按所切下的产物凝胶质量，加入 3 倍体积溶胶液 PN。50水浴 10min，期间上下颠倒数次，确保胶块充分溶解。若依旧有未溶胶块，补加适量溶胶液或延长水浴时间，直至胶块完全溶解。待冷却至室温的胶块溶解液加入一个吸附柱 CA2 中，室温放置 2min，13000*g 离心力离心 45s，丢弃流出液。加入 600L 漂洗液 PW 到吸附柱 CA2 中，13,000*g 离心力离心1min。丢弃流出液，将吸附柱 CA2 放入
23、收集管中。重复本操作一次。将吸附柱 CA2 放置收集管中， 14000*g 离心 2min，除尽漂洗液。室温放置吸附柱 CA25min，彻底地晾干，避免残留的漂洗液对下一步的实验造成影响。将吸附柱 CA2 置于一个干净离心管中，加入 35LddH2O(pH8.0)到吸附膜中间位置，室温放置 2min。13000*g 离心 2 min 收集 DNA 流出液。将离心所得溶液重新加回吸附柱中，室温放置 2min，13000*g 再次离心 2min，得到纯化后的条形码 PCR 产物。（2）电泳检测纯化后的条形码 PCR 产物用 0.5%的琼脂糖凝胶电泳检测纯化后的条形码 PCR 产物。取 5L AL2
24、000 做对照 ,取 5L 纯化产物与 1L 610 Lodaing Buffer 混合后，点样于凝胶孔中，设置电泳仪 U=120V，I=220mA ，25 分钟后取出凝胶置于凝胶成像系统中紫外灯源下观察 PCR 产物条带。2.4.3 克隆（1）纯化产物低温连接于超净工作台上吸取 4L 纯化后的条形码 PCR 产物、1L T Vector和连接液 Solution至同一 PCR 管中，轻弹管壁，使各组混合均匀，用手掌型离心机快速离心，集中溶液，然后置 PCR 管于 PCR 仪上，16连接20min。反应结束后将离心管置于冰上。（2）大肠杆菌转化在超净工作台上，取 50L 感受态细胞并同时加入 5L 连接产物(在感受态细胞刚刚解冻时加入链接产物)，轻弹混匀后于冰中 30min；结束后， 42水浴，热激 30S，迅速再次冰浴 2min；向混合液离心管中加入 250L 灭菌 LB 培养基（不含氨苄青霉素），混
