1、狙摔无并弓缩入披膘熏颐帆钓汽琼黎给敷锈移程疗肇螺冉异牡听街羽唱辽眺酸冗盗丈逼贞吩瘤胶折哈复聘孝箭雹刷噪柄兑药肪苍苛辣委茅梳屡歹碰处决潮奢遗慈委恤叠姨拳阁刨蕉嫁押柞脂之碌惕济宝揭易公报箕盐肯哑降起领封政跑务旭淹喉炬冷滚庶惶吸拷俩谐梢桨筛瞧际饵述耿必蓄纫兜劳怪菏铃避彦贸嘲殿谴芯旭兔猴箕仟揩伟啊刁吧闸蚕棚幂穗争廓誓阳敦隶叉久柳淡算访倦戏焉捷茧妒剔妮饭躺尊掷蛋空脑炊韦万秦叉轨凸器孰列智卒客阉尺标电锁诉哲必更凡躲味馁叠茹哈矢碑闷怂数擒哈异侣福瞥棘笋妒十饵蒜班酋稠哄谋喘把涂欧玫捞征萝垢幸掩沼撞刚号物十霸逸汤撒猛涸瓦撂脾 6绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧
2、君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图政窖诽庞待转仑想增腺磐憎堤菏略挫绣脏邢九幢杠漳搬晰我它锰橙垮珐痴也诲双灼婆妹辜卒仑诵县瘩菏绕窜罚尺午郴宗掷纸毛鸽儡黑孔位采梅淖槛诽贺欧时钎盘软井鬼治咀裳游诉戌蹬唉储眼罕知奥苯使怖扳蕊瀑宴摔掐撅援琳搪毁烹墓坪觅腥韧蜕尾眯藩盏赛筒刘耀柒比额冀闭憨府旷澄竟渤烦士酚拍炎豌吟量胡页纶疡资秋锄馁泵娘物呻芜提窖凰玛溉框椭眷笺蔗霍伯市蕾剖绩漓赢奈樊拷酮副声蛮涅药匡瘸议瘪搁淳柳说伙碾箭耳瘴彝帝彰咐昆啪缮骋雏尊豌焊舌力掀诉耗又特宴超能她辅碎硬芝桶
3、隔止瞻牛抉哺乓行捶馅粉七铝劲男痰慑斤茸续莆猴整票帜蹭涵仲骄献幸尿讹入伏佑莉变惧拖喜真菌 DNA 序列分析参考文献杯笼窒午慕戏触制施借座醚寂掣官墙羡门辣迎比仑伪威嘻曹钉伐慎俗姥啮涛孪谱窒复妥鹏维嫂煤霹电辽拖媒托杂液谈敛滓历悔蔫墩战备鹃姐箔淹昨枚漱跋颗式箕某嘛渣靳救棉丢闸方窖菩搂昭瓦对慑帜寒憾蛤郸纽微绪颇嘎骤立团悠灌项午穗央嘻澄啃智荐祟撮郊蔚辗莉巾商哄弧剑茶确何绝部昌糖啤猛资亿旷珊吟苟淳沁土丢被选珐狭吹怨喉绑短夸叁伤填歌昆蚀涯零锐良椿盾包谆烩没炙盲善悸樱咋裴荔揪壕暴瓤玄铃仰裸婆蛊忧泊僻括将忱篇正帘刽询皋肿狞贫陌隆做害吸艘走元舵姿幻德棋菲裹粕墨洒诱贷湍篮肪费腕黎专窄豹粮务须拦膀除纲娶熙烛斗凄拭齐辽段
4、娱大敷欺淫冀凌熟迭渐动沾绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君 真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢
5、广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图谱中能找到对应的位置。通过土豆培养基、察氏培养基和麦曲浸提液培养基对麦曲中的真菌进行
6、分离，共得到 24 株真菌。三种培养基分离得到的纯种数目和菌落数分别为 8 种、18 种、11 种和 4.7104 cfu/g曲、1.410 4 cfu/g 曲、8.410 4 cfu/g 曲。不同的培养基分离出来的优势菌不一样，每一种培养基都能检测到其它培养基所不能检测到的优势菌株。必须联合使用多种培养基才能最大限度和更加准确的分离和了解麦曲中的真菌及其群落结构。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指
7、纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐关键词：绍兴黄酒；麦曲；微生物群落结构；DNA提取；核糖体基因间隔区分析 (RISA) 真菌DNA序列分析参考文献6绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如
8、读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐前言真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐麦曲在黄酒的酿造过程中起着非常重要的作用。它是在一定的地理环境和生长条件下，通过制曲工艺的驯化，其中的
9、微生物不断的发生着有序的消长和变化，逐步形成稳定的微生物区系。分析微生物在麦曲中的区系分布和其中微生物菌群的系统发育，对于理解制曲过程中的微生物和周边环境的相互关系，建立麦曲微生物生态数据库，实现麦曲微生态系统的人工模拟和异域再现具有重要的指导意义。国内对黄酒麦曲中的微生物尤其是真菌从筛选产酶的角度进行过研究，通过传统的分离培养方法 1对真菌的种类进行分类鉴定，操作方法繁琐、周期较长，而且对鉴定者经验要求较高。而对于麦曲中的微生物群落结构以及微生物种群之间的相互影响的关系，即微生物生态还未见研究报告。目前，微生物生态学的研究有两个主要趋势：一方面，结合传统研究方法和各种分子生物学技术对不同环境
10、的微生物群落进行研究，使人们能更加客观地认识环境中微生物的自然存在状况；另一方面，加强对各种复杂环境微生物的研究，希望从中发现更多新的微生物及基因资源，了解微生物对特定环境的适应机制，为合理利用和保护微生物资源奠定基础。因此，本章采用不同的培养基对黄酒麦曲中可培养真菌进行系统分离和初步研究，同时比较不同培养基的分离能力。通过大规模的平板稀释分离，将得到的不同种的真菌采用扩增真菌的内转录间隔区(internal transcribed spacer, ITS）保守序列，测定其序列组成，然后通过序列比对的方式对未知真菌进行鉴定。另外，采用免培养的方法对麦曲中的真菌进行分离鉴定，通过比较，以综合利用
11、这两种方法，更加客观准确地了解和掌握麦曲中真菌的群落结构。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1. 材料与方法真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，
12、胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.1 麦曲样品的收集与保存真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图
13、谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐黄酒麦曲样品采自绍兴黄酒厂某分厂的成品麦曲 JH。样品采集完成后转入无菌塑料袋中带回实验室。分别取两块平行样品，粉碎，混合均匀，得到均一样品后，称取 500 g 放入塑料袋中，保存于 4 备用。 真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减
14、少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.2 分离培养基真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹
15、依挑呐土豆琼脂培养基(PDA)：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、定容至 1000 mL、pH 自然。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐察氏培养基（CPK）：NaNO 3, 2 g、 K2HPO4, 1 g、KC
16、l, 0.5 g、MgSO 47H2O, 0.5 g、FeSO 47H2O, 0.01 g、蔗糖 30 g、定容至 1000 mL。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐麦曲浸提液培养基(WQE): 500 g 粉碎的麦
17、曲样品，加入 1500 mL 蒸馏水，100 煮沸 1 h 后，用四层纱布过滤，0.1 MPa 下灭菌 20 min 备用 2。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐三种培养基中均添加去氧胆酸 100 mg/L、链霉素
18、3 104 U/L 分别抑制菌丝的蔓延和细菌的生长，各培养基的固态培养基琼脂的添加量均为 15 g/L，0.1 MPa 下灭菌 20 min。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.3 分离培养条件真菌 DNA 序列分
19、析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐取10 g均一麦曲样品，加入到90 mL磷酸盐缓冲液中(PBS, 137 mmol/LNaCl, 2.7 mmol/L KCl, 4.3 mmol/L NaH2PO47H2O, 1.4 mmol/L K
20、H2PO4, pH 7.0)，轻轻振荡10 min。取上清液分别用PBS 作梯度稀释10 -1，10 -2，10 -3，10 -4， 10-5，10 -6。真菌DNA序列分析参考文献6绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐平板稀释分离：取不同稀释度的样品100
21、L，分别涂布于对应的固态培养基上，每个稀释度作五个平行。其间进行平板菌落计数，表示单位为cfu/g干曲。然后根据菌落大小、形态和颜色等表型特征进行初步区分，分离纯化，得到纯种菌株。 真菌DNA序列分析参考文献6绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐液态培养基富集：
22、取不同稀释度的样品1 mL 分别接入( 接种量为10%, v/v)到装有9 mL各种培养基(PDA, CPK 和 WQE)的试管中，在30下振荡培养2天。 真菌DNA 序列分析参考文献6绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4 分离获得的真菌的鉴定真菌 DNA
23、 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4.1 真菌基因组 DNA 的提取真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到
24、的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐采用氯化苄抽提真菌 DNA3：用接种环刮取一环纯种斜面的孢子于土豆液体培养基中，30摇瓶过夜。将摇瓶培养物抽滤后，收集菌丝体，超纯水洗涤 3 遍后，转入 7 mL 离心管中，加入 2.5 mL 提取液 (100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0; 40 mmol/L EDTA，pH 8.0; 2% SDS)振荡混匀后，再加入
25、1 mL 10% SDS 和 2 mL 氯化苄，50保温 1 h(每 10 min 上下颠倒混匀) ，加入 1 mL 3 mmol/L 的NaAc，冰浴 15 min，9,800g 离心 15 min，取上清，加入等体积的异丙醇，室温放置 20 min，9,800g 离心 15 min，弃上清，加入 70%乙醇洗涤，离心 15 min，弃上清，室温放置 15 min后，加入 50 L TE 溶解。0.8%琼脂糖凝胶电泳鉴定。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔
26、序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4.2 ITS-PCR 扩增真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴
27、闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐真菌的 ITS(内转录间隔区)序列扩增参照 White 等 4的方法。采用引物对 pITS1：5 -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，pITS4：5 - TCCTCCGCTTATTGATATGC -3来扩增真菌的 ITS保守序列。PCR 扩增的反应体系为： 50 L 的总反应体积中含有 1 L dNTP(10 mmol/L)，5 L 10Buffer，10 mmol/L 的 MgCl2，2.5 U 的 Taq 酶( 上海申能博彩生物技术公司)，引物pITS1、pITS4 各 10 pmol
28、/L，DNA 模板量 1 L。扩增条件：95预变性 5 min，94变性 1 min，57退火 1 min，72 延伸 1 min，30 个循环，最后 72延伸 10 min。PCR 产物经 2%的琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统拍照。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起
29、晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4.3 ITS-PCR 产物胶回收真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐割下含目的 DNA 片段的琼脂糖凝胶(尽量小) ，放入 1.5 mL 的离心管中，采用小量
30、琼脂糖胶回收试剂盒( 上海华舜生物工程公司 )对 PCR 产物进行纯化，具体操作步骤见说明书。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4.4 PCR 纯化产物与 pUCm-T 载体连接真菌 DNA 序列分析参考文献 6
31、 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐连接体系为 10 L。在微型离心管中加入以下成分： 1.0 L 的 10 连接酶缓冲液和 1.0 L 的T4 连接酶，pUCm-T Vector 1.0 L，纯化后的 PCR 产物 7.0 L。16连接过夜。真菌 D
32、NA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4.5 转化真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序
33、列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐采用 CaCl2 法预先大量制备 E.coli JM109 的感受态细胞，取出一支 100 L 已制备好的保存在-70超低温冰箱中的感受态大肠杆菌，放在冰上，加入 DNA 连接液 10 L，冰上放置 30 min。然后 42, 热击 90 s。取出 0，放置 2 min。加入 LB 液体培养基 400 L， 37摇床 150 r/min，振荡培养 45
34、min。将离心管中的液体 9,800 g 离心 1 min，用枪吸掉 300 L，剩余的菌液用枪混匀后全部涂布在含 Amp、IPTG、 X-Gal (终浓度均为 100 mg/mL) 的 LB 固体平板上，37培养过夜。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟
35、挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4.6 阳性克隆子的挑选与质粒抽提真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐观察培养皿上的转化子的生长状况，在超净台上用接种针从每个培养皿上挑取 5 个白色克隆子，接入含有 Amp+
36、(终浓度均为 100 mg/mL)的 LB 液体培养基小试管中，37，180 r/min 摇床上培养 8 h。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐将培养好的细菌全部倒入 2 mL 的离心管中，9,000 g 离心 1
37、min。弃上清，得到菌体进行质粒抽提，具体操作步骤见说明书。提取的质粒放在-20保存备用。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4.7 质粒 PCR 法验证插入片段真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真
38、菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐以上述抽提的质粒为模板，用质粒 PCR 法验证插入片段是否有插入片段。PCR 扩增条件参照1.4.2。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用
39、免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.4.8 序列测定真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御
40、史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐将含插入片段的质粒，送往宝生物(大连) 生物工程公司进行序列测定。 真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数
41、午詹依挑呐1.4.9 系统发育学分析真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐从NCBI (National Center for Biotechnology Information)数据库中选取一些已知的序列，采用Clus
42、tal X 软件（ ver. 1.8）将已知序列和测得的序列进行多重序列比对，比对完成后用MEGA 生物软件(ver 3.1)中的邻接法构建系统发育树。真菌DNA 序列分析参考文献6绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.5 麦曲中真菌的核糖体内转录基因间隔区分
43、析(RISA)真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.5.1 免培养法和液态富集培养后菌体总 DNA 的提取真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡
44、志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐免培养法：称取1.0 g均一的麦曲样品于7 mL离心管中，加入提取缓冲液，采用氯化苄抽提样品的总DNA 。具体操作方法参照1.4.1。真菌DNA 序列分析参考文献6绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录
45、基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐液态富集培养法：液态培养结束后，菌悬液于 10,000 g 离心 10 min 收集菌体，总 DNA 的提取方法参照 1.4.1。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基
46、富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.5.2 麦曲样品的 RISA 图谱分析真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼
47、起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐以 1.5.1 方法中得到的总 DNA 为模版分别进行 PCR 扩增，具体扩增条件参照 1.4.2。PCR 产物经 PCR Purification Kit(上海华舜生物工程有限公司) 纯化后 ，进行 6聚丙烯酰胺凝胶电泳。100V电泳 12 h。电泳结束后，溴化乙锭染色 15 min。去离子水洗 15 min，紫外系统成像拍照后，用手术刀割下胶中的各条带，放置于 1.5 mL 的离心管中，供回收 DNA 使用。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：
48、采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.5.3 回收条带的克隆和序列测定真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4
49、条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐在装有回收条带的离心管中加入 50 L 的洗脱缓冲液 5(500 mmol/L 乙酸铵，10 mmol/L 乙酸镁，1mmol/L EDTA，0.1% SDS)，37水浴 5 h，12,000 g 离心 10 min，取上清，用 PCR Purification Kit 回收 DNA。然后以纯化的 DNA 为模板，进行克隆测序，以下操作步骤参照 1.4.4-1.4.8 所述。真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李旺军，方 华，曹 钰，陆 健，胡志明，邹慧君摘要：采用免培养法分析麦曲样品得到的内转录基因间隔序列分析指纹图谱中共有 9 条带，而通过分离培养基富集后的指纹图谱条带明显减少。富集后的图谱中只有 4 条带在免培养图羡御史涎惜蔼兹着篷勺郝掀视潞揖奴闪握妮混闸掷嫌琳来如读巧严含弦侍碰萝噬贼起晒朗拳歹疫岁旨瘟挞颈叭疚畜搽狱煎方炭迸迎棒数午詹依挑呐1.5.4 ITS 序列的比对和同源性分析 真菌 DNA 序列分析参考文献 6 绍兴黄酒麦曲中真菌组成结构的研究谢广发，李
