1、蛋白质组学,王玮,Proteome,Genome,细胞mRNA水平不能代表蛋白质表达水平,从基因组较难预测蛋白质的修饰及调控,也无法预测蛋白质之间的相互作用,蛋白质组学（Proteomics）,“.the analysis of complete complement of proteins. Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the determination of their localization, modifications, interac
2、tions, activities, and, ultimately, their function.“ Stanley Fields, University of Washington, Seattle, in Science (2001) 291, 1221,蛋白质组学的两种研究策略：采用高通量的蛋白质组研究技术，分析生物体内尽可能多乃至接近所有的蛋白质。 研究不同时期细胞蛋白质组成的变化，如蛋白质在不同环境下的差异表达，以发现有差异的蛋白质种类为主要目标。,蛋白质组学的研究范围和研究方法：蛋白质的表达谱（expression profile）双向电泳-质谱/多维色谱-质谱 蛋白质的翻译后
3、修饰（磷酸化） 蛋白质-蛋白质相互作用酵母双杂交/噬菌体展示/蛋白质芯片,双向电泳，2-DE,双向电泳后，每个蛋白质都相应于样品中的每种蛋白质分子，同时获得蛋白质的等电点、分子量和每种蛋白质的数量信息。,pH 3 - - - - - - 10,（1） IEF 等电聚焦电泳,（2） SDS-PAGE,（3） 染色脱色,双向电泳图， 摘自于“电泳皇后” Angelika Grg,http:/www.wzw.tum.de/proteomik/ (Grg实验室的主页， 有大量2D相关资料）,从双向电泳到质谱的研究流程,蛋白酶解,蛋白酶解片段,蛋白点,双向电泳 凝胶成像,样品,MALDI-TOF,毛细管
4、电泳 或HPLC,氨基酸序列测定,数据分析,LC/MS/MS,切胶,凝胶扫描系统,图像分析技术,2-DE分离的蛋白质组成分通过染色、荧光显影后，经扫描或摄影等转换为以像素为基础、具有不同灰度强弱和一定边界方向的斑点的电脑信号，可用2-DE图像分析软件包PDQuest，Melanie，Phoretix和Image Master对一系列具有低背景染色和高度重复性的2-DE凝胶进行图像分析。,Image analysis,PDQuest (Bio-Rad Laboratories) Set of gel images from experiment Matching of gels (match s
5、et including master) Spot editing Comparison (analysis sets) Choice of spots for analysis (protein identification)Tutorial（指南）,Sample 1 a,Sample 1 b,Sample 1 c,Is this gel to gel variation or biological variation?,双向电泳图像分析,1a,Replicate 1,Replicate 2,Replicate 3,1a,1a,1b,1c,1b,1b,1c,1c,重复实验增加可信度,荧光差异
6、凝胶电泳（DIGE）技术,DIGE 实验流程,DIGE 实例图,混合物内标 Cy2,肿瘤组织 Cy3,正常组织 Cy5,使用内标的好处：实例一,使用内标的好处：实例二,使用内标的好处：实例三,蛋白点的切取、酶解与点样,Proteomics,Mass Spectrometry,Database Search,1.,3.,3. Mass spectrometry (MS) to characterise protein spots,4. Database searches to identify proteins,1. 2D-PAGE to separate proteins,2. Image a
7、nalysis to determine the volume of protein spots,2D-PAGE,Image Analysis,2.,4.,（Robotics）机器人技术,Robotics (1)Gel-spot excision Driven from gel image Cuts out gel spots Transfers to microtitre plates,Robotics (2)Protein digestion Washes gel pieces Digests with trypsin Extracts peptides Desalts peptides
8、Applies peptides to MALDI plate,质谱技术：质谱（ Mass Spectrometry，MS）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（m/z）的大小顺序排列的图谱。 质谱仪是一类能使物质粒子电离为离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。 质谱仪主要由分析系统、电气系统和真空系统组成。,质谱技术发展史：1897，Thomson JJ 在研究阴极射线过程中首创抛物线质谱装置（Nobel Physics 1906）。 1919，Aston FW，速度聚焦质谱仪（ Nobel Chemistry 19
9、22 ）。 1946，Stephens WF，飞行时间质量分析器。 1950s 中期，Paul W，四极杆质量分析器，离子阱质量分析器（Nobel Physics 1989）。 1981，Barber M，快原子轰击电离（第一个可用于蛋白质和多肽的电离技术）。 1987-1989，田中耕一、Karas M / Hillenkamp F，基质辅助激光解吸电离；Fenn JB，电喷雾电离（田中耕一，Fenn JB： Nobel Chemistry 2002）。由于以上几项革命性的创新，质谱成为研究蛋白质结构最有效的工具之一，同时也成为蛋白质组学的核心和支撑技术。,MS（mass spectrum）
10、 -常用于分析生物大分 子的软电离质谱技术,电喷雾电离质谱（Electrospray Ioniztion Mass Spectrometry，ESI-MS） 基质辅助激光解吸电离质谱(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Sepctrometry,MALDI-MS) 快原子轰击质谱（Fast Atom Bombardment Mass Sepctrometry,FAB-MS） 离子喷雾电离质谱（Ion spray Ionization Mass Sepctrometry,ISI-MS） 大气压电离质谱（Atmospheric Pres
11、sure Ionization Mass Sepctrometry,API）,蛋白质组学中常用的电离技术：基质辅助的激光解吸电离（Matrix assisted laser desorption / ionization，MALDI）Karas M and Hillenkamp F. Anal Chem (1988) 60: 2299-2301电喷雾电离（Electrospray ionization，ESI）Fenn JB et al. Science (1989) 246: 64-71,MALDI 原理图,ESI 原理图,电喷雾电离质谱（ESI-MS）,ESI 实例图：nano-ESI,M
12、ALDI 与 ESI 的比较,质量分析器,蛋白质组学中使用的质量分析器主要有飞行时间（TOF）、四极杆与离子阱质量分析器。其中，MALDI 多与TOF 技术联用而组成 MALDI-TOF 质谱仪；ESI 多与四极杆及离子阱联用。质谱的质量分析器可串联为串联质谱（MS/MS、MS/MS/MS），如 TOF/TOF，Q-TOF 等。ESI 技术在组建串联质谱方面具有一定优势。,质谱技术在蛋白质组学中的应用,蛋白质与多肽分子量测定肽质指纹图（Peptide mass fingerprint，PMF）。蛋白质与多肽序列测定ESI-MS/MS 技术CAF-MALDI 技术蛋白质半胱氨酸位点的确定,MAL
13、DI-TOF 测定蛋白质的分子量,ESI-MS 测定蛋白质的分子量,肽质指纹图,One Peptide,B-ions / Y-ions,三、蛋白质组生物信息学,由三大部分组成 数据库 计算机网络 应用软件,历史上，蛋白质数据库先于核苷酸数据库。20世纪60年代初期，Margaret Dayhoff提出这样一个设想，将文献中所有的蛋白质序列汇总在一起，可能是研究中 非常有用的工具。于是Dayhoff和她在华盛顿特区的“美国生物医学研究基金会（National BiomedicalResearch Foundation，NBRF）”的合作者们一道收集所有已知的序列组合成一个蛋白质序列图谱集。随 后
14、，每当新出现一种蛋白质序列，即与该图谱比对，以找出与其它蛋 白质的关系，这就使得一些不同蛋白质之间序列相识区域被鉴定出 来。他们的收集中心即为后来的“蛋白质信息资源（Protein Information Resource，PIR）”。,几种重要的蛋白质数据库,SWISS-PROTSWISS-PROT是对数据人工审读很严格的库。可以说，只有实际存在的蛋白质才被收入.每一条数据都有详细注释，包括功能、结构域、翻译后的修饰等，以及齐全的引文和到许多其他数据库的链接。一般说，任何蛋白质序列数据的搜寻和比较都应当从SWISS-PROT开始。,SWISS-PROT Web Site (http:/www
15、.expasy.ch/sprot/),SWISS-PROT中的数据来源于不同源地：（1）从核酸数据库经过翻译推导而来；（2）从蛋白质数据库PIR挑选出合适的数据；（3）从科学文献中摘录；（4）研究人员直接提交的蛋白质序列数据,TrEMBLTrEMBL(http:/www.ebi.ac.uk/trembl/index.html) 是与SWISS-PROT相关的一个数据库。包含从EMBL核酸数据库中根据编码序列(CDS)翻译而得到的蛋白质序列，并且这些序列尚未集成到SWISS-PROT数据库中。 TrEMBL有两个部分：（1）SP-TrEMBL(SWISS-PROT TrEMBL)包含最终将要集成
16、到SWISS-PROT的数据，所有的SP-TrEMBL 序列都已被赋予SWISS-PROT的 登录号。（2）REM-TrEMBL(REMaining TrEMBL)包括所有不准备放入SWISS-PROT的数据，因此这部分数据都没有登录号。,PIR（Protein Information Resource） 目的：帮助研究者鉴别和解释蛋白质序列信息，研究分子进化、功能基因组。它是一个全面的、经过注释的、非冗余的蛋白质序列数据库。 所有序列数据都经过整理，超过99%的序列已按蛋白质家族分类，一半以上还按蛋白质超家族进行了分类。,除了蛋白质序列数据之外，PIR还包含以下信息：(1)蛋白质名称、蛋白质
17、的分类、蛋白质的来源；(2)关于原始数据的参考文献；(3)蛋白质功能和蛋白质的一般特征，包括基因表达、翻译后处理、活化等；(4)序列中相关的位点、功能区域。,PIR Web Site (http:/pir.georgetown.edu),目前，欧洲生物信息学研究所EBI 将上述3个蛋白质数据库（即PIR 、SWISS-PROT和TrEMBL）统一起来，建立了一个蛋白质数据仓库UniProt（Universal Protein Resource）。 用户可以通过文本查询数据库，可以利用BLAST程序搜索数据库，也可以直接通过FTP 下载数据。, UniProt,酵母双杂交系统应用,鉴定新的蛋白与
18、蛋白相互作用 鉴定蛋白级联底物 鉴定突变对蛋白与蛋白结合的影响 在已知的相互作用中鉴定干扰蛋白质 (反向双杂交系统),酵母双杂交的原理,利用酵母作为真核蛋白相互作用的模型 利用诱饵质粒筛选文库或者单个已知蛋白 通过报告基因的转录鉴定蛋白的相互作用,酵母双杂交模型,DNA-Binding Domain,Bait Protein,Prey Protein,Transcription Activating Region,Reporter Gene,DNA-Binding Site,模型,文库筛选的步骤,将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒 将诱饵质粒转化缺乏报告
19、基因启动子的酵母细胞株中，选择被转化的酵母 再将文库质粒转化到酵母中 通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白,序列分析,从酵母中分离质粒然后转化E. coli 从大肠杆菌中提取质粒并测序 在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性,报告基因,LacZ reporter - Blue/White Screening HIS3 reporter - Screen on His+ media (usually need to add 3AT to increase selectivity) LEU2 reporter - Screen on Leu+ media URA3 reporter - Screen on Ura+ media (can do negative selection by adding FOA),酵母双杂交的优点,快速获得相互作用蛋白的基因 在体内鉴定蛋白的相互作用 弱小的，暂时的相互作用也能鉴定 能在整个时间段积聚弱小的相互作用信号,谢谢！,
