1、专题 3 DNA的粗提取与鉴定一、基础知识（一）提取 DNA的方法1.提取生物大分子的基本思路选用一定的物理或化学方法，分离具有不同物理或化学性质的生物大分子2.提取 DNA的基本思路提取 DNA，去除其他成分利用 DNA与 RNA、 蛋白质 和 脂质 等在物理和化学性质方面的差异 DNA 的溶解性 DNA和蛋白质等成分在不同浓度的 NaCl溶液中溶解度不同利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使 DNA充分溶解，而使杂质沉淀；或者让其他成分溶解，DNA析出3.DNA等大分子的理化性质 DNA不溶于酒精溶液 DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性DNA不溶于酒精溶液，但细胞中某些蛋白质则溶于酒精。将 D
2、NA与蛋白质进一步分离。 DNA不溶于酒精溶液 DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性 蛋白酶 水解蛋白质，对 DNA没有影响 高 温 大多数蛋白质不能忍受 60 80而 DNA在 80 以上才会变性 洗涤剂 溶解细胞膜，去除脂质和蛋白质但对 DNA没有影响试剂：（二） DNA的鉴定条件：二苯胺沸水浴条件下，DNA遇二苯胺被染成 蓝色沸水浴现象：（一） 实验材料的选取（二） 破碎细胞，获取含 DNA的滤液（三） 除去滤液中的杂质 (纯化 )（四） DNA的析出与鉴定二、实验设计（一）实验材料的选取从下列材料中选取 2 3种原则：菜花、香蕉、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜；鱼卵、猪肝、鸡血、哺乳动物的红细胞
3、；在液体培养基中培养的大肠杆菌选用 DNA含量相对较高的组织（二）破碎细胞，获取含 DNA的滤液1、动物细胞2、植物细胞 容易破碎 需要溶解细胞膜鸡血细胞溶液：加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液想一想：为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分大量进入血细胞，使血细胞胀裂；加上搅拌作用，加速鸡血细胞细胞膜、核膜破裂，从而释放出 DNA 加入一定的洗涤剂和食盐 充分的 搅拌和研磨，过滤后收集研磨液想一想：洗涤剂和食盐的作用分别是什么？洗涤剂 离子去污剂，能溶解细胞膜，利于 DNA释放食 盐 NaCl，利于 DNA的溶解于研磨液中经研磨可破碎细胞
4、壁，使细胞核内的 DNA释放。若研磨不充分，会使提取的 DNA量变少，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。为了纯化提取的 DNA需要将滤液作进一步处理讨论：滤液 /研磨液中可能含有哪些成分？答：可能含有核蛋白、多糖和 RNA等杂质想一想：研磨的目的是什么，如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？方法步骤 加入物质 目的 1.制备鸡血细胞液 柠檬酸钠溶液 2.提取鸡血细胞细胞核物质 20 m1蒸馏水 幻灯片 18 3.溶解细胞核内的 DNA 2 mo1 L 的 NaCI溶液 40mL 幻灯片 18 4.析出含 DNA的黏稠物 蒸馏水 5.滤取含 DNA的黏稠物 6.将 DNA的黏
5、稠物再溶解 2 mol L 的 NaCl溶液 20 mL 7.过滤含 DNA的 NaCl 溶液 8.提取含有杂质较少的 DNA 冷却的 95的酒精 50 mL 幻灯片 18 A:(1)向试管中加入 2mol/L的 NaCl溶液 5mL (2)加入 DNA (3)4 mL 二苯胺试剂9.DNA的鉴定 B:(1) (2)4 mL 二苯胺试剂 混匀后，置于沸水浴中加热 5min向试管中加入 2mol/L的 NaCl溶液 5mL 混匀后，置于沸水浴中加热 5min1. DNA的溶解性2. DNA对 酶 、 高温 和 洗涤剂 的耐受性（三）除去滤液中的杂质讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？方案二：利
6、用蛋白酶分解杂质蛋白，使提取的 DNA与蛋白质分开；方案三：利用 DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，使蛋白质变性，与 DNA分离（四） DNA的析出与鉴定与滤液 体积相等 的 冷却 的 酒精溶液 (体积分数 95 )，静置 2 3min，溶液中会出现白色丝状物 粗提取 DNA用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水1、 DNA的析出2. DNA的鉴定 向两支试管中分别加入 2mol/L NaCl 溶液 5ml 其中一支试管中加入 DNA丝状物 各加入 二苯胺 试剂 4ml 混匀后，置于沸水浴中加热 5min 待冷却后，比较两只试管中溶液的颜色变化观察现象： 溶解丝状物的溶液变为
7、 蓝色 加入柠檬酸钠溶液的目的是防止血凝固 加速血细胞破裂 溶解 DNA 使 2mol/L的 NaCl溶液稀释至 0.14mol/L使得 DNA最大限度地释出 使含 DNA的黏稠物被留在纱布上 使含 DNA的黏稠物尽可能多的溶解于溶液中 除去含 DNA的滤液中的杂质 提取 DNA A出现蓝色 B无变化观察你提取的 DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明 DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的 DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备四、课题成果评价（一）是否提取出了 DNA练习1、请解释提取 DNA的实验操作中主要的步骤的目的。答：提取 D
8、NA的 第一步是材料的选取 ，其目的是一定要选取 DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难； 第二步是 DNA的释放和溶解 ，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的 DNA全部溶解； 第三步是 DNA的纯化 ，即根据 DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将 DNA与杂质分开； 最后一步是对 DNA进行鉴定 ，这是对整个实验的结果的检测。2、你认为从细胞中提取某种特定的蛋白质与提取 DNA一样容易吗？答： 提取蛋白质比提取 DNA的难度大 。这是因为，与 DNA相比， 蛋白质对温度、盐浓度、 pH等条件要敏感得多，很容易失活 ；
9、并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性质各不相同，使得蛋白质的提取 没有一种统一的方法 ，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。2.实验中 NaCl的物质的量浓度为 2 mol L和0.14 mol L对 DNA有何影响 ?1.在 DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加入蒸馏水的作用是 ( )。A.稀释血液、冲洗样品B.使血细胞破裂、降低 NaCl浓度使 DNA析出C.使血细胞破裂、增大 DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的 DNA答： B答：前者是溶解 DNA，后者是使 DNA析出3.DNA遇二苯胺 (沸水浴 )会染成 ( ) A.砖红色 B.橘黄色 C.紫色 D.蓝色4.提取鸡血中的 DNA时，为什么要除去血液中的上清液 ?答： DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含 DNA，所以要除去上清液 (含有蛋白质 )。答： D
