1、文件编号 文件版本号 负责部门 品管部页 码 110微生物限度检查作业指导 书实施日期 2005.9.24目的：建立微生物限度检查的标准操作规程，为微生物检验人员提供正确的操作方法。范围：适用于辅料、内包材料和所有产品的微生物限度检查。职责：检验人员对本规程的实施负责。参照标准：GB/T4789.3-2003,GB/T4789.15-2003,GB/T4789.2-2003内容：1 概述微生物限度检查法系指非规定灭菌制剂及其原、辅料受到微生物污染程度的一种检查方法，包括染菌量及控制菌的检查。供试品一般按批号随机抽样；抽样量应为检验用量（2 个以上最小包装单位）的 3 倍量（以备复检） 。检验的
2、全过程，均应严格遵守无菌操作，严防再污染。2 仪器与用具恒温恒湿培养箱、生化培养箱、恒温水浴、高压蒸汽消毒锅、电热恒温干燥箱；试管、锥形瓶、量筒、培养皿（90mm） 、刻度吸管、研钵；托盘天平或电子天平、镊子、剪刀、酒精灯、打火机、编号笔、75%酒精棉球；拖鞋、无菌衣、裤、帽、口罩。以上玻璃器皿、镊子、剪刀等洗净、晾干，160170干烤 2h，备用。所有灭菌物品存放于第一缓冲间，不应超过 2 周即用毕。否则，应重新灭菌。3 培养基、试液配制营养琼脂培养基（细菌用） 、孟加拉红培养基（虎红琼脂培养基，霉菌用） ，胆盐乳糖培养基（即 BL，用于大肠杆菌增菌培养） 、4甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）培
3、养基（用于大肠杆菌快速检查） 、麦康凯琼脂培养基（即 MacC，用于肠道菌分离培养） 、蛋白胨水培养基（供靛基质试验用） 、磷酸盐葡萄糖胨水文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限度检查作业指导书 页 码 210培养基（供甲基红及 VP 试验用） 、枸橼酸盐培养基（供枸橼酸盐利用试验用） ；营养肉汤培养基、四硫磺酸钠亮绿培养基（TTB，沙门菌增菌用） 、胆盐硫乳琼脂（DHL ）或沙门、志贺菌属琼脂（SS ）培养基（用于沙门菌分离培养） 、麦康凯琼脂或曙红亚甲蓝琼脂培养基（大肠杆菌及沙门菌分离培养用） 、三糖铁琼脂（TSI）斜面培养基（肠道菌初步鉴别用）的配制及灭菌方法参见中国药典2000
4、 年版一部附录C。0.1%2,3,5-氯化三苯基四氮唑（TTC）溶液（供制备培养基用） 、氢氧化钾试液（供作 VP 反应试剂） 、萘酚乙醇溶液（供作 VP 试剂） 、靛基质试液。的配制及灭菌方法参见中国药典 2000 年版一部附录C。稀释剂：0.9%无菌氯化钠溶液、无菌磷酸盐缓冲液（PH7.2） 。4 操作过程4.1 试验前的准备4.1.1 将所有已灭菌的培养皿、锥形瓶、研钵、试管、吸管、量筒、稀释剂及供试品等通过传递窗进入无菌室内，每次试验所用物品必须事先计划，准备足够用量，避免操作中出入。将全部包装去掉，编号。4.1.2 开启紫外灯 30 分钟（或臭氧发生器 1h）和空气过滤装置 30 分
5、钟，进行空间灭菌处理。4.1.3 操作人员用肥皂洗手，关闭紫外线杀菌灯（或臭氧发生器） ，进入缓冲间，换工作鞋。再用 0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）消毒液洗手或乙醇棉球擦手，穿戴无菌衣、帽、口罩、手套。4.1.4 操作前先用乙醇棉球擦手，再用乙醇棉球（或碘伏棉球）擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围，待干后用灭菌的手术剪刀将供试品瓶、盒、袋启封。启封后先检查包装内侧及周围有无生霉、长螨迹象，若经证实为生霉、长螨即可判为不合格，无须继续检验。4.1.5 定期检查无菌环境的空气是否符合规定。文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限度检查作业指导书 页 码 3104.2 操作4.2.1 细菌、霉菌
6、与酵母菌4.2.1.1 以无菌操作，称取检样 25g(ml)，加入含 225ml 灭菌水的具玻塞锥形瓶中，振摇 30min,即为 1：10 稀释液。4.2.1.2 用灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 10ml，注入灭菌试管中，另用 1ml 灭菌吸管反复吹吸 50 次，使霉菌孢子充分散开。4.2.1.3 取 1 支 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 均匀供试液 1ml，沿管壁加入装有9ml 灭菌稀释剂的试管中，混匀即 1：100 供试液。以此类推，根据供试品污染程度，可稀释至 1：10 3 或 1：10 4，细菌选择两至三个稀释度，霉菌选择三个稀释度。4.2.1.4 在进行 10 倍递增稀释的同时，
7、以该稀释级吸管吸取每级稀释液各 1ml置每个灭菌平皿中，每稀释级注 2 个平皿。另取 1 支 1ml 吸管吸取稀释剂各 1ml 注入 2 个平皿中，作为阴性对照。4.2.1.5 将融化并冷至约 45的培养基注入上述各个平皿约 15 ml，以顺时针或反时针方向快速转动平皿（勿使培养基溢出）使供试液与培养基混匀，放置，待凝。4.2.1.6 将已凝固的平板倒置于适宜温度的培养箱中，培养。细菌于 361培养 482 小时，霉菌、酵母菌于 2528培养，3 天后开始观察，共培养观察 5 天。4.2.1.7 将平板置菌落计数器上或从平板的背面直接以肉眼用标记笔点计，以透视光衬以暗色背景，仔细观察，计数。4
8、.2.2 大肠杆菌取胆盐乳糖培养基 3 份，每份 100ml，2 份分别加入规定量的供试液，其中1 份加入对照菌 50100 个作阳性对照，第 3 份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。培养 1824 小时（必要可延至 48 小时） 。阴性对照应无菌生长。取文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限度检查作业指导书 页 码 410上述 3 份的培养物各 0.2ml，分别接种至 5ml MUG 培养基管内培养，分别于 5小时与 24 小时时，取未接种的 MUG 培养基管作本底对照，将各管置 365nm 紫外光下观察。阳性对照管呈现荧光，MUG 阳性。供试液的 MUG 管呈现荧光，MUG 阳性
9、：无荧光，MUG 阴性。然后加数滴靛基质试液于 MUG 管内，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。当阴性对照呈阴性，阳性对照正常生长，供试液胆盐乳糖培养基培养液澄明，并证明无菌生长，判未检出大肠杆菌。供试液 MUG 阳性，靛基质阳性，判检出大肠杆菌；MUG 阴性，靛基质阴性，判未检出大肠杆菌。如 MUG 阳性、靛基质阴性，或 MUG 阴性、靛基质阳性，均应取供试液胆盐乳糖培养基培养物划线于曙红亚甲蓝琼脂平板或麦康凯琼脂平板，培养1824 小时，如上述供试液培养物的分离平板无菌落生长，判未检出大肠杆菌。或有菌落生长，应挑选 23 可疑菌落作靛基质试验（） 、甲基红试验（M ） 、乙酰甲基甲醇
10、生成试验（V-P） 、枸橼酸盐利用试验（C）及革兰染色、镜检，按下表判断结果。MUGI 曙红亚甲蓝琼脂 IMVic 结果+ + 检出大肠杆菌 未检出大肠杆菌+ 无菌生长 未检出大肠杆菌+ 有菌生长 + 检出大肠杆菌 + 有菌生长 + + 检出大肠杆菌注：如出现+或出现+ ，均应重新分离菌株，再作 MUG-I 和 IMVic 试验。 革兰氏阴性杆菌。4.2.3 沙门菌：取营养肉汤培养基 3 份，每份 100ml，2 份分别加入规定量的供试液，其中1 份加入对照菌液作阳性对照，第 3 份加入与供试液等量的稀释液作阴性对照。文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限度检查作业指导书 页 码 51
11、0培养 1824 小时，阴性对照应无菌生长。取其余 2 份培养物各 1 ml，分别接种于四硫磺酸钠亮绿培养基 10 ml 中，培养 1824 小时。分别划线接种于胆盐硫乳琼脂（或沙门、志贺菌属琼脂）培养基和麦康凯琼脂（或曙红亚甲蓝琼脂）培养基的平板上，培养 1824 小时或延至 4048 小时。当阳性对照的平板呈现阳性菌落时，供试品的平板无菌落生长，或有菌落但不同于下表所列特征时，可判为未检出沙门菌。培养基 菌 落 形 态胆盐硫乳琼脂 无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全黑色或无色沙门、志贺菌属琼脂无色至淡红色，半透明或不透明，菌落中心有时带黑褐色曙红亚甲蓝琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明
12、，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂 无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色如供试品平板生长的菌落特征有与上表所列形态特征相符或疑似者，均应挑选 23 个菌落分别接种于三糖铁琼脂培养基斜面上，阳性对照同时接种该培养基，培养 1824 小时后，阳性对照的斜面应为红色，底层为黄色，硫化氢阳性，而供试品的疑似菌斜面未见红色、底层未见黄色，可判为未检出沙门菌。否则，应继续做靛基质试验、脲酶试验、赖氨酸脱羧酶试验、动力检查、血清凝集试验。5 注意事项5.1 供试品在检验之前，应保存在阴凉干燥处，勿冷藏或冷冻，以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死，损伤或繁殖。供试品在检验之前，应保持原包装状态，严禁
13、开启。包装已开启的样品不得作为供试品。5.2 除另有规定外，供试品制备成供试液后，应在均匀状态取样。文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限度检查作业指导书 页 码 610制成供试液后，应在 60 分钟内注皿操作完毕。5.3 配制后的培养基应及时灭菌，避免细菌繁殖。培养基不应有沉淀，如发生沉淀，应趁热过滤。5.4 制备妥的培养基应在冷暗处保存，放置时间不能过长，锥形瓶的琼脂培养基保存时间最长不能超过一个月，以免水分散失染菌。5.5 勿用电炉直接融化琼脂培养基，以免营养成分过度受热而破坏。5.6 注皿时培养基应在 451，高于 45时易造成细菌受损或致死，低于45时易凝固，因此使用前应水浴
14、保温。5.7 细菌、霉菌与酵母菌及控制菌必须做阴性对照试验（目的：测试检验全过程无菌技术的可靠性） ，控制菌必须做阳性对照试验（目的：检查供试品是否对控制菌生长产生干扰作用，同时检查培养条件是否适宜） 。5.8 阳性对照试验操作必须与供试品检验操作严格分开，避免交叉污染。5.9 做完试验后，用消毒液清洁，开紫外灯照射 30 分钟（或臭氧发生器 1h） 。6 结果判定菌数报告及结果判定按中国药典 2005 年版二部附录C。附件 1 霉菌与酵母菌检验程序文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限度检查作业指导书 页 码 710附件 2 细菌检验程序文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限
15、度检查作业指导书 页 码 810附件 3 大肠杆菌检验程序供试液供试品胆盐乳糖培养基文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限度检查作业指导书 页 码 910附件 4 沙门菌检验程序 MUG-I+ +MUG-I+ MUG-I +MUG-I 判检出大肠杆菌 判未检出大肠杆菌报告 报告EMB 或麦康凯琼脂无菌落生长 有菌落生长判未检出大肠杆菌 普通肉汤琼脂斜面报告革兰氏染色镜检 靛基质试验 甲基红试验 VP试验枸橼酸盐报告供试品V10 供试液预增菌（营养肉汤）文件编号 文件版本号 负责部门 品管部微生物限度检查作业指导书 页 码 10101824h 3611824h 3613611824h（或延至 4048 h）361增菌（四硫磺酸钠亮绿培养基）胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺菌属琼脂平板曙红亚甲兰琼脂平板或麦康凯琼脂平板三 糖 铁 琼 脂 斜 面靛 基 质 试 验脲 酶 试 验赖氨酸脱羧酶试验动 力 检 查血清凝集试验报 告
