1、 湖南临武舜华鸭业发展有限责任公司微生物作业指导书文件编号：版本：页数：生效日期：2011 年编写：_ 日期：_审核：_ 日期：_批准：_ 日期：_分发日期：目录前言：微生物检验员工作流程1第一部分：准备工作3第二部分：微生物检验相关技术7第三部分：相关仪器设备的使用10第四部分：具体的检测方法131. 高清洁区空气沉降菌检测方法.132. 食品直接接触面卫生微生物检验.153. 食品用水卫生微生物检验.174. 菌落总数的测定195. 大肠菌群的测定.236. 商业无菌的检测出 .26第五部分：相关表格321前言微生物检验员工作流程一、 目的做好原料、成品的微生物实验，新品的保质期跟踪实验，
2、检验生产过程中高清洁区的卫生情况，保证成品的微生物指标符合要求。二、 工作职责1负责原辅料、半成品、成品、实验品、工器具、人员、自来水等微生物检测，并做好相关检验记录。2负责成品采样、留样以及送检样品的采集、编号、登记、保管、更新，月底与车间函接所采样品的归还以及相关数据的核实工作。3配合研发部做好新品的微生物跟踪检验工作。4负责相关记录的整理、归档、保管工作。5负责总结分析月度/年度微生物检测情况。6负责所使用仪器的保养及维护。三、 主要工作流程A、月初/年初做好工作计划B、具体的检测工作1准备工作 填写微生物检测台帐 将剪刀、烧杯、垃圾袋、包装完好的非透明包装样品、酒精灯、75%酒精棉、镊
3、子、电子称放入无菌室，工作服、工作帽、工作鞋、口罩放入缓冲间进行紫外线消毒 30min，关闭紫外灯过一会才能进入无菌室进行无菌操作。 将吸量管用报纸包好、培养皿码好，分别放入相应的金属筒内，在恒温鼓风干燥箱内进行干热灭菌，160，2h，取出冷却至室温。 准备相应数量的 9ml 及 225ml 生理盐水（0.85%） ；同时按操作说明配好所需培养基，烧开、冷却、分装。2 将准备好的生理盐水及培养基放入灭菌锅入进行湿热灭菌（121，15min） ，注意不可放得太过紧密，否则可能会灭菌不完全。灭完待压力降至 0，取出冷却至室温，查看液体培养基内的小倒管是否有气泡，将有气泡的剔除；培养基应放在水浴锅内
4、或放在灭菌锅内使之保持在 45左右。2无菌操作及培养参考 GB4789.2-2010、GB4789.3-20103结果与报告依据 GB4789.2-2010、GB4789.3-2010 中的相关内容出具微生物检测原始记录。4及时输入电脑，整理电子版的台帐。C、每月对工器具、人员、自来水（直接加入到食品中去的）等进行微生物检测。D、月底与车间函接所采样品的归还以及相关数据的核实、整理、归档相关记录、做好微生物检测情况的总结分析。E、注意所使用仪器的保养及维护主要包括以下几个方面： 培养箱：保证培养箱内的湿度，方法是用一个小容器装一些水放入到培养箱内；定期对增养箱进行清洗消毒。 灭菌锅内最好加蒸馏
5、水，加热用水每个星期换一次，怕结起的水垢堵住排气管。F、每天要对所使用的工器具进行清洗，接种了致病菌的移液管或是长了较多细菌、培养了致病菌的培养基及其它相关的用具均要进行灭菌之后方可清洗，保持整个工作环境的干净整洁，特别要注意窗户的卫生。四、相关文件记录GB789成品微生物检测记录商业无菌原始记录成品出厂检验台帐高清洁区空气沉降菌原始记录饮用水微生物检测原始记录食品直接接触面的微生物检测原始记录 、3第一部分：准备工作一、无菌室的准备1. 无菌室的杀菌（1）紫外线灯照射 在每次工作前后均应打开紫外线灯，分别照射 30min，进行杀菌。（2）熏蒸 先将室内打扫干净，打开无菌室的门通风干燥后，重新
6、关闭好再进行熏蒸杀菌。常用的熏蒸药剂为福尔马林（含 37%40%甲醛的水溶液） 。按 6-10ml/m3 的用量盛于铁制容器中，加半量高锰酸钾，通过氧化作用加热使福尔马林蒸发。熏蒸后应保持密闭 12h 以上，最好是隔夜。甲醛气体未散尽而要使用无菌室时，则在使用无菌室之前 1-2h，按所用甲醛溶液量量取氨水，倒入搪瓷盘内，放入无菌室，使其挥发中和甲醛气体的刺激作用。除甲醛外也可用乳酸（细菌较多时） ，硫酸等进行熏蒸杀菌。(3) 石碳酸液喷雾 在进接种室操作前，用手持喷雾器喷 5%石碳酸溶液，主要喷于台面和地面，以防空气微尘飞扬。2. 无菌室操作的规则（1）将所用的材料、用品先全部放入无菌室内，以
7、避免在操作过程中进出无菌室或传递物品，使用前打开紫外线灯，照射半小时后，关闭紫外线灯，过一会儿才能使用。（2）进入缓冲间，换好消过毒的工作服、鞋、帽，戴上口罩。（3）操作前用酒精棉球擦手，然后严格按无菌操作进行工作。（4）工作后应将台面、地面收拾干净，废物丢入废物桶内。二、玻璃器皿的准备微生物学实验常用的玻璃器皿，主要有试管、吸管、培养皿、三角瓶、载玻片、盖玻片等，都需要经过清洗，达到无灰尘，无油垢和无机盐等杂质后，才能保证获得正确的实验结果，有的器皿还需经包装、灭菌后方能使用。41.洗涤剂的种类及应用（1）水：水是最重要的洗涤剂，但只能洗去可溶解于水的沾污物。油、蜡等不溶于水的沾污物则必须用
8、其它方法处理后，再用水洗。对于要求无杂质颗粒或无机盐离子的玻璃器皿，在用清水洗过后，应再用蒸馏水进行漂洗。（2）肥皂：肥皂是常用的很好的去污剂。有油污的器皿，通常用湿刷子涂抹一些肥皂后，刷洗器皿，再用水清洗。用 5%热肥皂水去油污能力也很强。（3）洗衣粉：洗衣粉有很强的去污、去油能力。用 1%的洗衣粉溶液洗涤玻璃器皿，特别是洗涤带油的载玻片和盖玻片，如果加热煮沸，则有很好的清洁效果。（4）洗涤液：重铬酸钾（或重铬酸钠）的硫酸溶液，是一种去污能力很强的强氧化剂，常用于玻璃或搪瓷器皿上污垢或有机物的清洗，但不能用于金属器皿。配好的洗涤液可多次使用，每次用完后倒回原瓶中保存，直至溶液变为青褐色时才失
9、去效用。使用洗涤液应尽量避免混入水分稀释。将洗涤液加热至 40-50后使用，可以加快作用速度，用洗涤液洗过的器皿，应立即用水冲洗干净。当器皿上带有大量有机物时，应先将器皿上的有机物尽量清除后，再用洗涤液洗涤，否则洗涤液很快失效。洗涤液具有很强的腐蚀性，溅在桌椅上，应立即用水洗并用湿布擦拭，皮肤及衣服上沾有洗涤液时，应立即用水冲洗，然后用苏打水（碳酸钠）或氨水洗去洗涤液。（5）浓硫酸与强碱液：器皿上如沾有煤膏、焦油及树脂类物质，可用浓硫酸或40%氢氧化钠溶液浸洗，处理所需时间随所沾物质的性质而定，一般只需 5-10分钟，有的需数小时。（6）有机溶剂：有时洗涤浓重的油脂物质及其他不溶于水也不溶于酸
10、或碱的物质，需要用特定的有机溶剂。常用有机溶剂有汽油、丙酮、酒精、苯、二甲苯及松节油等可根据具体情况选用。2.常用玻璃仪器的洗涤方法（1）新玻璃器皿的洗涤：新购置的玻璃器皿应用 2%盐酸溶液浸泡数小时后，再用水冲洗干净。5（2）用过的玻璃器皿的洗涤：盛过培养基的玻璃器皿，应先将培养物倒入或刮入废物缸中，另行处理。如对人有致病作用的培养物需经煮沸灭菌后再倒去及洗涤。（3）吸管的洗涤：吸取过一般液体的吸管，用后浸没在盛有清水的容器内，切勿使管内物干燥以免增加洗涤的麻烦。吸过菌液的吸管，应先浸入 5%石碳酸溶液内，经 5 分钟以上灭菌后，再浸入清水中；吸过油脂液体的吸管，应先浸入10%氢氧化钠溶液中
11、，浸 1 小时以上，再进行清洗。无菌操作所用过的吸管，应先用钢针将棉塞取出后再洗涤。吸管洗涤后可倒立于垫有干净纱布的容器中，待水滤干后再用，如急用可放电烤箱内 60-70烤干备用。（4）载玻片及盖玻片的洗涤：新载玻片和盖玻片，应先在 2%的盐酸溶液中浸泡 1 小时，后用自来水冲洗，再用蒸馏水洗 2-3 次，也可用 1%的洗衣粉洗涤。用洗衣粉洗涤时应先将洗衣粉液煮沸，后将载片散开放入煮沸液中，持续煮沸10-15 分钟（勿使玻片露出液面以防钙化变质） 。冷却后用自来水冲洗，再用蒸馏水换洗 2-3 次。如再用洗衣粉洗涤新盖玻片时则只能在煮沸的洗衣粉中保持1 分钟，待泡沫平下后再煮沸 1 分钟，如些反
12、复 2-3 次（煮沸时间过长，会使盖片钙化，易碎） ，冷却后再用自来水冲洗，蒸馏水换洗。用过的载玻片，洗涤方法同上，但应先擦去表面油垢后再用洗衣粉液煮，煮沸的时间以 30 分钟为好，其余处理方同上法。洗涤后的载、盖玻片，可以烘干或晒干后放在干净的容器内或用干净纱布包好备用。3. 玻璃器皿的包装灭菌在微生物学工作中需要无菌的玻璃器皿。如无菌吸管，无菌培养皿等，这些玻璃器皿在灭菌之前需要进行隔离包装，常用的包装方法有：（1）培养皿的包装：洗净干燥后的培养皿，可放在特制的金属容器中，或可按6-10 套培养皿为一组，用旧报纸卷起来，将两端封严，放入恒温鼓风干燥箱内160，2 个小时进行灭菌。（2）吸管
13、的包装：无菌操作用的吸管洗净干燥后，首先在吸管上端的管口内塞棉花，作为隔离及过滤杂菌之用。棉柱长度不少于 1cm，一般用脱脂棉为宜，用量根据吸管口径大小而定，以塞得不紧不松为宜，棉花不能弄湿，以免影响6空气的流通和滤菌效果，吸管塞好棉塞后用旧报纸包好，也可用金属制成的专用圆筒，将塞好棉柱的吸管成批放入，经 160，2 个小时灭菌后随时抽用。三、棉塞的制作技术1. 棉塞的作用和要求一般情况下：培养微生物用的试管和三角瓶均需加棉塞（或中性海绵硅胶塞） 。用是既要空气的流通，以保证供足微生物生长所需的氧气，又要滤除空气中的杂菌，避免污染。制作棉塞的基本要求是：松紧适度，太紧影响通气，太松则影响过滤除
14、菌的效果。插入的部分长度要恰当，一般为容器口径的 1.5 倍，过短则易脱落。外露部分应略为粗大些，且比较整齐硬实，便于手握取。2. 棉塞的制作方法制作棉塞应采用普通棉花，脱脂棉易吸水不宜用。制作方法：根据所做棉塞的大小，选取一块棉花，铺成长方形，把长边的两头各叠进一段，使其叠齐加厚。按住短边把棉花卷起来，卷时两手紧捏中间部分，两头不要卷得太紧，卷成后，从中间折起并拢。插入试管或三角瓶中，深度为容器口径的 1.5 倍。新做的棉塞弹性比较大，不易定形。插在容器上经过一次加压蒸汽灭菌后形状和大小便基本可固定。为了便于无菌操作，减少棉塞的污染机率，延长棉塞的使用时间，可在棉塞外面包上 1-2 层纱布，
15、并用棉线扎住纱布断口。四、培养基的制备及灭菌培养基煮沸分装后用牛皮纸包好，于 121，15min 进行高压蒸汽灭菌。7第二部分：微生物检验相关技术一、无菌操作技术1.平板接种技术a. 平板划线法（分离培养）首先将琼脂培养基融化并冷却到 45-50，在酒精灯火焰旁，以右手的无名指及小指夹持棉塞，左手打开无菌培养皿的盖的一边，右手持三角瓶向皿里注入 15-20ml 培养基，将培养皿稍加旋转摇动后，置于水平桌面待其冷凝制成平板。然后在酒精灯火焰上灼烧接种环，待其冷却后，以无菌操作法取 1 环菌液（试管斜面菌苔）伸入平板内划线。划线时，琼脂平板可放在台子上也可以持在手中。左手握琼脂平板，在火焰旁稍抬起
16、皿盖，右手持接种环伸入皿内，在平板上第一个区域沿 S 字形来回划线。划线时使接种环与平板表面成 30-40角轻轻接触，以腕力使接种环在琼脂表面作轻快地滑动，勿划破表面。灼烧接种环，待其冷却后，将手中培养皿旋转 70角，用接种环在划过线的第一区域接触一下，然后在第二区域划线，并依次对第三区域和第四区域进行划线。划线完后，将整个培养皿反转倒置于恒温培养箱内，隔日观察结果。b. 倾注平板法（菌落总数）在无菌操作条件下将菌种制成一定稀释倍数的菌悬液，然后用无菌移液管吸取菌液入无菌皿中。以无菌操作法，将融化后冷却至 45左右（手握三角瓶不觉烫手为宜）的琼脂培养基，向加有菌悬液的培养皿内，倒入 15-20
17、ml，迅速旋转培养皿，使培养基和菌悬液充分混匀，水平旋转放置。待其凝固后，将平板反转倒置于恒温培养箱中培养，观察记录结果。c.平板涂布法(接种霉菌)同“平板划线法”先制备琼脂平板备用，在无菌操作条件下将菌种制成一定稀释倍数的菌悬液，以无菌操作法，将一定稀释倍数的菌悬液，用无菌移液管取8一定量于琼脂平板表面，用无菌玻璃刮铲将菌液均匀涂布于整个平要表面即可。静置 30 分钟，将培养皿反转倒置于培养箱中，观察生长情况。二、染色镜检1. 细菌简单染色法步骤：涂片干燥火焰固定冷却染色水洗干燥镜检。A. 涂片：在干净的载玻片中央加一小滴蒸馏水，用接种环以无菌操作法从斜面取出少量培养物，在载玻片上与水混合后
18、，用接种环涂成均匀的薄层，自然晾干或微微加热使之干燥。B.固定：手持载玻片的一端，标本面朝上，如钟摆的速度在酒精灯火焰上通过2-3 次，通过高温处理，使菌体易着色，同时可使菌体牢固地粘附在载玻片上，以免水洗时被水冲洗掉。C. 染色：经火焰固定的涂片，待冷却后，滴加数滴石碳酸复红液于涂片上，并使其完全涂抹，染色 1-2 分钟。D.水洗：倾去染料，将载玻片斜置，用细水从玻片的上端流下，洗去多余的染料，直至流水变清为止。冲洗时勿直接用水冲洗涂菌处。E.干燥：用吸水纸吸干，或置空气中自然干燥，或微微加热，以加快干燥速度。F.镜检2.细菌革兰氏染色法A.原理：由于细菌细胞质壁的化学组成及结构不同和通透性
19、不同可将细菌分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。若菌体呈紫色则为革兰氏阳性菌，若菌体呈红色则称革兰氏阴性菌。B.步骤：涂片自然干燥火焰固定结晶紫染色（1 分钟）水洗碘液媒染（1 分钟）水洗95%酒精脱色（30 秒）立即水洗蕃红复染（1 分钟）水洗晾干（干燥）镜检 涂片固定：取被试菌体，按简单染色法涂片固定。9 染色：待玻片冷却后进行染色。先用结晶紫染色 1 分钟，水洗多余染料，再加碘液媒染固定 1 分钟，水洗。 （每次水洗后均不需干燥） 脱色：手持载玻片的一端，斜置，用 95%的酒精，一滴一滴地加于涂片的上部，直到流下的酒精不现紫色时，约 30 秒，立即用水冲洗。 复染：用蕃红复染 1 分钟，水洗
20、、自然干燥。 先用低倍镜观察，待找到物象部位后，再用油镜观察。革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。 注意事项：涂片上的菌液不能太浓，而且涂抹均匀，否则影响脱色的均匀及观察效果。酒精脱色时间的长短，可以直接影响实验结果，脱色时间过长，阳性菌误染成阴性菌；反之，阴性菌误染成阳性菌；因些必须严格掌握酒精脱色程度的准确性。相关染色液的配制见 GB/T4789.28，现将常用的几种 罗列如下：1.齐氏石炭酸复红染色液A 液： 碱性复红 0.3g，酒精（ 95%）10ml（用玛瑙研钵研磨配制）。B 液：石炭酸 5g，蒸馏水 95ml。混合 A、B 二液即成。通常可将上述原液稀释 5-10 倍使用。稀释
21、液易变质失效，一次不宜多配。2.草酸铵结晶紫染色液A 液： 结晶紫 2.5g，酒精（ 95%）25ml。B 液： 草酸铵 10g，蒸馏水 100ml。将结晶紫研细后，加入 95%酒精使之溶解，配成 A 液；将草酸铵溶于蒸馏水配成 B 液，混合 A、B 二液即成。3.路戈氏碘液碘 1g，碘化钾 2g，蒸馏水 300ml。先将碘化钾溶于小部分的蒸馏水，然后加碘片并摇荡，使碘片完全溶解后，再加其余的蒸馏水至足量，即成。104.沙黄（番红）染色液沙黄 0.25g，95%乙醣 10ml，蒸 馏水 90ml。将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。第三部分：相关仪器设备的使用1. 高压蒸汽灭菌的使用方法（以
22、手动式灭菌锅为例）：（1）加水：首先将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜，加水不可过少，否则易将灭菌锅烧干，引起暴炸事故。（2）装锅：放回灭菌桶，将待灭菌物品放入桶内。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角瓶与试管口端不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎纸而透入棉塞。（3）加盖：将灭菌锅盖盖上，并将盖上的排气软管插入内层灭菌的排气槽内。再以对角线的方式同时旋紧相对称的两个螺栓，并使螺栓松紧一致，勿使漏气。（4）加热排气：接通电源对灭菌锅加热使水沸腾产生蒸汽，约 105时打开排气阀，以排除锅内冷空气，待冷空气完全排尽即直到放气阀门放出大量热蒸汽时，关
23、上排气阀，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。（5）保温保压：当锅内压力升至所需压力时，控制热源，维持压力（温度）到所需时间。（6）降温出锅：灭菌所需时间到后，关掉电源，让灭菌锅内温度自然下降。当灭无带倒管的培养基及其它物品时，当压力表的压力降至 0 时，就打开排气阀，旋松固定螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。注意，如果压力未降到 0 时打开排11气阀，就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而造成培养基猛烈沸腾冲出管口或瓶口，污染棉塞，以后培养时引起杂菌污染。当灭菌带倒管的培养基时，要注意等灭菌锅内气压和温度都降到与室温一致或相差不大时再打开灭菌锅。锅压力表示数为 0 而温度
24、表示数还高于室温时，不要打开灭菌锅。因为打开锅盖瞬间，锅内大量热量散出，温度突然降低，试管内温度也随着降低，导致管内气体减小，沸点降低，部分水会汽化留在小导管内。（7）保养：灭菌完毕取出物品后，将锅内余水倒出，以保持内壁及搁架干燥。盖好锅盖（勿拧螺栓） 。灭菌锅里的水若用自来水，每天一换；若用蒸馏水一周一换。2. 使用恒温鼓风干燥箱的注意事项：（1）灭菌物品在箱内不能堆放太满，一般不要超过总容量的 2/3，灭菌物之间应留有一定空隙。（2）灭菌物品不能直接放在烘箱的底板上，即使需要放得很低，也要用铁筐子架起。灭菌物品的包装物，如纸、棉花或纱布等，不能接触到烘箱的铁板，因为铁板温度一般高于箱内空气
25、温度，容易烘焦着火。（3）灭菌温度以控制在 160-170保持 1-2 小时为宜。超过 170，包装纸就将变黄，超过 180，纸或棉花等就会烤焦至燃烧。如因不慎或其它原因烘箱内发生火花或棉花烤焦或燃烧的事故时，应立即先关闭电源，令其自行降温到 60以上时，才能打开箱门，切勿在未断电源前打开箱门，以免促进燃烧造成更大事故。（4）正常情况下，灭菌完毕，让其自然降温到 60以下再打开箱门取出灭菌物品，以免骤然降温使玻璃器具爆破。3. 显微镜的使用（1）调节光照正确的照明是获得良好观察效果的前提。调节光照步骤如下：A.将低倍镜旋转到镜筒下方，旋转粗调螺旋使镜头和载物台距离约 0.5cm 左右。B.先将
26、光圈完全开放，上升聚光器，使之与载物台表面相距 1cm 左右。12C.调节光照的大小，使得到最适宜的照明。一般染色标本用油镜检查时，光度宜强，可将光圈开大，光源开到最大；观察未染色标本时，应适当地缩小光圈，调暗光源，否则光线过强不易观察。（2）低倍镜观察低倍镜（410）视野广，焦点浓度较大易于发现目标确定检查位置。其操作步骤是：A.先将标本片置于载物台上，并将标本部位处于物镜的正下方，转动粗调焦螺旋，下降物镜至距标本约 0.5cm 处。B.双眼看目镜，同时反时针方向慢慢旋转粗调焦螺旋，使镜筒缓缓上升，使物镜头与标本片的距离缓慢拉大，至视野内出现物象后，改用细调焦螺旋，上下缓缓转动，仔细调节焦距
27、和照明，同时移动推动器，将所要观察的标本部位移至视野中心，直至视野内获得清晰的物及恰当的部位。（3）高倍镜观察将高倍镜（10或 45）顺时针方向转至镜筒下方， （在转换物镜时，应从侧面注视，以防镜头与玻片相撞） 。调节光圈和照明灯使光线亮度适中，再仔细反复转动微调焦螺旋，调节焦距以获得清晰物象，仔细观察染色标本并移动推动器，选择最满意的镜检标本部位，移至视野中央。待油镜观察。（4）油镜观察细菌或其他标本的微细结构，都需要用油镜观察。油镜（90或 100） ，由于物镜放大倍数与其焦点距离长度相反，即物镜放大倍数越高，其工作距离越短，一般油镜的工作距离在 0.19mm 左右，故使用油镜必须特别小心
28、，其操作步骤如下：A.用粗调焦螺旋提起镜筒（约 1cm） ，将油镜转至镜筒下方。在玻片标本的镜检部位，滴一滴香柏油，从侧面注视，用粗调焦螺旋将镜筒缓慢小心降下，使油镜的末端浸入香柏油内直到几乎接触载玻片，但切勿触及玻片，否则油镜头不仅压碎载坡片，而且还会碰损油镜头的前透镜。B.观察，调节光圈和照明灯使光线亮度适中，再用粗调焦螺旋将镜筒及缓慢地上升，直至视野内出现物象为止（注意绝对不能将粗调焦往下扭，使镜筒下降，以免物镜与玻片相碰而损坏镜头） 。然后用微调焦螺旋校准焦距，直到很清13晰地看到目的物。C.如果油镜头离开油滴，仍未见标本上的物象时，则可重新按上述步骤仔细操作，直到看清目的物为止。（5
29、）显微镜的保养油镜使用完毕后，必须先用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再换用擦镜纸沾少量二甲苯擦试镜头，然后立即换用干净擦镜纸将镜头上多余的二甲苯擦净。用专用的绒布将镜身擦干净，将显微镜的各部位归还原位，最后一手握持镜臂，一手托着镜座将显微镜放回镜箱中。3. 生化培养箱（1）保证培养箱内的湿度，方法是用一个小容器装一些水放入到培养箱内。（2）定期对培养箱进行清洗消毒。第四部分：具体的检测方法1.高清洁区空气沉降菌检测方法参照标准：GB/T 16294-2010， 医药工业洁净室沉降菌的测试方法一、样品采集：(1)取样频率：a)产品检验结果超内控标准时，应及时对车间进行采样，如有检验不合格点整改后再进
30、行采样检验。b)正常生产状态的采样，每月一次。（2）采样方法在动态下进行(生产时) ，室内面积不超过 30 m2，在对角线上设里、中、外三点，里、外点位置距墙 1 m；室内面积超过 30 m2，设东、西、南、北、中五点，周围 4 点距墙 1 m。采样时，将含平板计数琼脂培养基的平板(直径 9 cm)置采样点(离地 80-150mm)，并避开空调、门窗等空气流通处，打开平皿盖，使平板在空气中暴露 5 min。采样后必须尽快对样品进行相应指标的检测，送检时间不14得超过 6h，若样品保存于 04条件时，送检时间不得超过 24h。（3）采样注意事项 布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。
31、采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。 培养皿在用于检测时，为避免培养皿运输或搬运过程造成的影响，宜同时进行对照试验，每次或每个区域取一个对照皿，与采样皿同法操作但不需暴露采样，然后与采样后的培养皿一起放入培养箱内培养，结果应无菌落生长。二、菌落培养：（1）在采样前将准备好的平板计数琼脂培养基平板置 371 培养 24 h，取出检查有无污染，将污染培养基剔除。（2）将已采集样品的培养基在 6 h 内送实验室，细菌总数于 371培养48h 观察结果，计数平板上细菌菌落数。（3）菌落计算：a) 记录平均菌落数，用“个/皿”来报告结果。用肉眼直接计数，标记或在菌落计数器上点计，然后用
32、510 倍放大镜检查，不可遗漏。b) 若培养皿上有 2 个或 2 个以上的菌落重叠，可分辨时仍以 2 个或 2 个以上菌落计数。C) 计算公式：M 平 =（M 1+M2+Mn）/nM 平 平均菌落数M1 1 号培养皿菌落数M2 2 号培养皿菌落数Mn n 号培养皿菌落数n 培养皿的皿数三、 结果评定落下菌数 空气污染程度 评价30 以下 清洁 安全1530-50 中等清洁 安全50-70 低等清洁 应加注意70-100 高度污染 对空气要进行消毒100 以上 严重污染 禁止加工2.食品直接接触面卫生微生物检验参考标准：GB15982-1995一、样品采集：(1) 取样频率：a)产品检验结果超内
33、控标准时，应及时对车间可疑处进行擦拭，如有检验不合格点，整改后再进行擦拭检验。b)正常生产状态的擦拭，每月一次。（2） 采样方法：a) 工作台（机械器具）：用浸有灭菌生理盐水的棉签在被检物体表面（取与食品直接接触或有一定影响的表面）取 25cm2 的面积，在其内涂抹 10 次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含 100mL 灭菌生理盐水的采样管内送检。b) 工人手：被检人五指并拢，用浸湿生理盐水的棉签在双手手指曲面（采样面积约为 30 cm2） ，从指尖到指端来回涂擦 10 次，然后剪去手接触部分棉棒，将棉签放入含 10mL 灭菌生理盐水的采样管内送检。16（3）采样注意事项：擦拭时棉签要随
34、时转动，保证擦拭的准确性。对每个擦拭点应详细记录所在分场的具体位置、擦拭时间及所擦拭环节的消毒时间二、 细菌大肠菌群的检测培养:样液稀释：将放有棉棒的试管充分振摇。此液为 1：100 稀释液。如污染严重，可十倍递增稀释，吸取 1ml 1：100 样液加 9ml 无菌生理盐水中，混匀，此液为1：1000 稀释液。 （一） 、 细菌总数：（1）以无菌操作，选择 12 个稀释度各取 1ml 样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样） ，将已融化冷至 45左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿，每皿约 15ml，充分混合。（2）待琼脂凝固后，将平皿翻转，置 361 培养 48 h 后计数。（3
35、）结果计算：1.物体表面细菌菌落总数（cfu/cm 2）=（平皿上菌落的平均数采样稀释倍数）/采样面积2.手细菌菌落总数（cfu/cm 2）=（平皿上菌落的平均数采样稀释倍数）/302（二）大肠菌群：a) 以无菌操作，选择 3 个稀释度各取 1ml 样液分别接种到 BGLB 肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。b) 置 BGLB 肉汤管于 361培养 482h。记录所有 BGLB 肉汤管的产气管数。c) 结果报告：按 BGLB 肉汤管产气管数，查 MPN 表报告每平方厘米食品接触面中或每只手的大肠菌群值。三、结果评定菌落总数（CFU/cm 2） 评价010 可接受10100 轻度污染100 不可
36、接受173.食品用水卫生微生物检验一、样品采集：(1) 取样频率：a) 正常生产的情况下，每月一次，尽量采集不同的点。（2） 采样方法及注意事项：a) 自来水采样：采样瓶必须预先灭菌，在采自来水时，先用酒精灯灼烧水笼头嘴后将水笼头完全打开 13min,再以无菌操作采取水样。b) 取其他水源的水样时，应选择有代表性的地点及水质可疑的地方，一般应距水面 1015cm 深处取样。C) 采取有余氯的水样时应按 250ml 的水样加入 1.5%的硫代硫酸钠溶液 1ml 于水样瓶的空瓶中，然后 121，15min 高压灭菌，以中和水样中的余氯，终止氯的杀菌作用。18d) 采样时所采的水量为容量的 80%左
37、右，以便在检验时可充分摇匀水样。e) 采得水样后应立即记录水样名称、地点、时间等项目，并从速检验，一般从采样到检验不应超过 2 小时，如放在冰箱中保存也不应超过 4 小时。二、 细菌大肠菌群的检测培养:样液稀释：将水要用力振摇 20-25 次，使可能存在的细菌团得以分散。此液为自来水原液；另吸取 1ml 原液加入到 9ml 无菌生理盐水中，混匀，此液为1：10 稀释液；再取 1ml1：10 的稀释液于 9ml 无菌生理盐水，混匀制成 1：100稀释液。 （一）菌落总数：（1）以无菌操作，选择 12 个稀释度各取 1ml 样液分别注入到无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿（平行样） ，将已融化冷至
38、45左右的平板计数琼脂培养基倾入平皿，每皿约 15ml，充分混合。（2）待琼脂凝固后，将平皿翻转，置 361 培养 48 h 后计数。（3）结果按 GB4789.2-2010 的计算方法计算和报告。（二）大肠菌群：a) 以无菌操作，选择 3 个稀释度（10 0、10 1、10 2）各取 1ml 样液分别接种到BGLB 肉汤培养基中，每个稀释度接种三管。b) 置 BGLB 肉汤管于 361培养 482h。记录所有 BGLB 肉汤管的产气管数。c) 结果报告：按 BGLB 肉汤管产气管数，查 MPN 表报告每 ml 自来水的大肠菌群值。三、结果评定菌落总数(cfu/ml) 大肠菌群（MPN/g）
39、水质清洁程度10100 0.3 极清洁水10210 3 0.3 清洁水10310 4 0.3 不太清洁水10410 5 0.3 极不清洁水194. 菌落总数的测定1、 菌落总数介绍1.1 菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度，与培养基混合，在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。1.2 菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定，即在需氧情况下，37培养 48h，能在普通营养琼脂平
40、板上生长的细菌菌落总数，所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌，由于现有条件不能满足其生理需求，故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际20中的所有细菌总数，菌落总数并不能区分其中细菌的种类，所以有时被称为杂菌数，需氧菌数等。1.3 菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量，它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。2 检验方法菌落总数的测定，一般将被检样品制成几个不同的 10 倍递增稀释液，然后从每个稀释液中分别取出 1mL 置于灭菌平皿中与营养琼脂培养基混合，在一定温度下，培养
41、一定时间后（一般为 48 小时），记录每个平皿中形成的菌落数量，依据稀释倍数，计算出每克（或每 ml）原始样品中所含细菌菌落总数。基本操作一般包括：样品的稀释接种倾注平皿培养 48 小时计数报告。 3 说明3.1 样品的处理和稀释：3.1.1 操作方法：以无菌操作取检样 25g（或 25ml），放于 225mL 灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振荡制成 1：10 的均匀稀释液。用 1ml 灭菌吸管吸取 1：10 稀释液 1ml，沿管壁徐徐注入含有 9ml 灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内，振摇试管混合均匀，制成 1：100 的稀释液。另取 1ml 灭菌
42、吸管，按上项操作顺序，制 10 倍递增稀释液，如此每递增稀释一次即换用 1 支 1ml 灭菌吸管。3.1.2 无菌操作：操作中必须有“无菌操作”的概念，所用玻璃器皿必须是完全灭菌的，不得残留有细菌或抑菌物质。3.1.2.1 所用剪刀、镊子等器具也必须进行消毒处理。样品如果有包装，应用75%乙醇在包装开口处擦拭后取样。3.1.2.2 操作应当在超净工作台或经过消毒处理的无菌室进行。琼脂平板在工作台暴露 15 分钟，每个平板不得超过 15 个菌落。3.1.2.3 采样的代表性：如系固体样品，取样时不应集中一点，宜多采几个部位。固体样品必须经过均质或研磨，液体样品须经过振摇，以获得均匀稀释液。213
43、.1.2.4 样品稀释误差：为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。在进行连续稀释时，应将吸管内液体沿管壁流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内，以免吸管外部粘附的检液溶于其内。3.1.2.5 稀释液：样品稀释液主要是灭菌生理盐水，有的采用磷酸盐缓冲液（或 0.1蛋白胨水），后者对食品已受损伤的细菌细胞有一定的保护作用。如对含盐量较高的食品（如酱油）进行稀释，可以采用灭菌蒸馏水。3.2 倾注培养3.2.1 操作方法：根据标准要求或对污染情况的估计，选择 23 个适宜稀释度，分别在制 10 倍递增稀释的同时，以吸取该稀释度的吸管移取 1ml 稀
44、释液于灭菌平皿中，每个稀释度做两个平皿。将凉至 45左右平板计数琼脂培养基注入平皿约 15ml，并转动平皿，混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入加有 1ml稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。待琼脂凝固后，翻转平板，置 361温箱内培养 482h，取出计算平板内菌落数目，乘以稀释倍数，即得每克（每毫升）样品所含菌落总数。3.2.2 倾注用培养基应在 46水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼脂易于凝因而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不烫为宜。倾注培养基的量规定不一，从 1520ml 不等，一般以 15ml 较为适宜，平板过厚可影响观察，太薄又易于干裂。倾注时，培基
45、底部如有沉淀物，应将底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观察。3.2.3 为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并旋转混匀，可正反两个方向旋转，检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过 20min，以防止细菌有所死亡或繁殖。3.2.4 培养温度一般为 37（水产品的培养温度，由于其生活环境水温较低，故多采用 30），培养时间为 48h2h。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平板培养 48h 后，培养基失重不应超过 15。3.2.5 为了避免食品中的微小颗粒或培基中的杂质与细菌菌落发生混淆，不易分辨，可同时作一稀释液与琼脂培基混合的平板，不经培养，而于 4环境中放置，以便计
46、数时作对照观察。在某些场合，为了防止食品颗粒与菌落混淆不22清，可在营养琼脂中加入氯化三苯四氮唑（TTC），培养后菌落呈红色，易于分别。3.3 计数和报告3.3.1 操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算出原始样品中每克（或每 ml）中的菌落数，进行报告。3.3.2 到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过 24h。3.3.3 若所有稀释度均不在计数区间。如均大于 300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于 30，则以最低
47、稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于 300，有的又小于 30，但均不在 30-300 之间，则应以最接近 300 或 30 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于 1 乘以最低稀释倍数报告之。3.3.4 不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。 如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。3.3.5 当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘 2 代表全平板的菌落数。3.3.6 当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于 300 时），但分布很均匀，可取平板的一半或 1/4 计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落
