微生物实验指导书-.doc

1、1微生物学实 验 指 导 书2目录实验一 玻璃器皿清洗、包扎与常用灭菌技术 3实验二 培养基的配制 .8实验三 从土壤中分离微生物及纯化 .11实验四 微生物的接种技术 .14试验五 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察 17实验六 细菌的简单染色和革兰氏染色 20实验七 大肠杆菌生长曲线的测定 .23实验八 实验室环境和人体表面微生物的检查 25实验九 乳酸菌的检测 .283实验一 玻璃器皿清洗、包扎与常用灭菌技术【目的要求】1. 学习并掌握棉塞制作的目的、原理及方法；2. 学习并掌握玻璃器皿清洗及包扎方法；3.掌握高压蒸汽灭菌的基本原理及操作方法。4.了解其它常用消毒灭菌技术原理及技术【基

2、本原理】棉塞的作用有二：一是防止杂菌污染，二是保证通气良好。因此，棉塞质量的优劣对实验的结果有较大的影响。微生物学实验所用的器皿，大多数要进行清洗、消毒、灭菌，才能用来培养微生物。玻璃器皿的包扎方法正确合理，在使用过程中才能有效防止杂菌的污染。玻璃器皿包扎好后，一般用高压蒸气灭菌法进行灭菌。高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到 100以上的高温，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。此外，常见灭

3、菌方法还有干热灭菌、灼烧灭菌、紫外线灭菌、过滤除菌等。对空间灭菌常使用甲醛加高锰酸钾熏蒸、喷洒消毒灭菌药剂等消毒灭菌方法。【实验用品】棉花，试管，培养皿，纱布，三角瓶，棉线，量筒，牛皮纸（或旧报纸） ，LDZX-50KBS 立式高压蒸气灭菌锅，常用灭菌用具、药剂等等。【方法步骤】一、棉塞的制作正确的棉塞要求形状，大小，松紧与试管口（或三角瓶口）完全适合，过紧妨碍空气流通，操作不便；过松则达不到滤菌的目的。制作过程见图 1，包括取棉花、整理、折角、卷紧、成形、塞试管等步骤。塞上棉塞时，应使棉塞长度的 1/3 在试管口外，2/3 在试管口4A. 内部框架 B. 带盖外筒图 3 培养皿金属灭菌筒内。

4、图 1 棉塞制作过程做棉塞的棉花要选纤维较长的，一般不用脱脂棉做棉塞，因为它容易吸水变湿，造成污染，而且价格昂贵。此外，在微生物实验和科研中，往往要用到通气塞，即用几层纱布（一般8 层）相互重叠而成，或是在两层纱布间均匀铺一层棉花而成。这种通气塞通常加在装有液体培养基的三角烧瓶口上。经接种后，放在摇床上进行振荡培养，以获得良好的通气促使菌体的生长或发酵，通气塞的形状如图 2。A. 配制时纱布塞法； B. 灭菌时包牛皮纸； C. 培养时纱布翻出图 2 通气塞二、玻璃器皿的清洗1. 不能用有腐蚀性的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用 2%的盐酸溶液浸泡数小时，用

5、水充分洗干净。2. 用过的器皿应立即洗涤。3. 强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须倒在废液缸内。4. 含有琼脂培养基的器皿可先将培养基刮去，或用水蒸煮，至培养基融化后倒出，然后再用洗洁精清洗。凡遇有传染性材料的器皿，应经高压蒸汽灭菌后再进行清洗。5. 一般的器皿可以用去污粉、肥皂或洗洁精清洗，油脂很重的器皿应先将油脂擦去。沾有煤膏、焦油及树脂一类物质，可用浓硫酸或 40%氢氧化钠或用洗液浸泡；沾有蜡或有油漆物，可加热使之熔融后揩去，或用有机溶剂（苯、二甲苯、汽油、丙酮等）揩去。6. 载玻片或盖玻片，先擦去油垢再清洗干净，然后在稀的洗液里浸泡 2 小时，用清水冲净

6、，最后用蒸馏水冲洗，干后浸于 95%酒精中保存备用。7. 洗涤后的器皿应达到玻璃壁能被水均匀润湿而无条纹和水珠。三、玻璃器皿的包装1. 培养皿的包装培养皿常用旧报纸紧紧包裹，一包 710 套，包好后干热或湿热灭菌。如果将培养皿放入金属筒内进行干热或湿热灭菌，则不必用纸包，金属筒有一圆筒形的5图 5 LDZX-50KBS 灭菌锅图 6 LDZX-50KBS 灭菌锅及控制面板带盖外筒，里面放一装培养皿的带底框架（图 3） ，此框架可自圆筒内提出，以便装取培养皿。2. 移液管的包装准备好干燥的移液管，在距其粗头顶端约 0.5 cm 处，塞约 1.5 cm 长的棉花，以免使用时将杂菌吹入其中，或不慎将

7、微生物吸出管外。棉花要松紧适当（过紧，吹吸液体太费力；过松，吹气时棉花会下滑） ，接着按图 4 方法包扎，后将移液管集中在一起，用一张大报纸包好，进行干热或湿热灭菌。图 4 移液管的包扎方法与步骤3. 试管和三角瓶的包扎试管管口和三角瓶瓶口塞上棉花塞或硅胶塞后，再用双层报纸包扎好（如有牛皮纸，效果更好） ，进行干热或湿热灭菌。试管较多时，一般 7 个或 10 个一组，再用双层报纸包扎。四、灭菌及净化设备操作技术（一）高压灭菌锅的使用利用高压水蒸汽高强度穿透细胞杀灭一切微生物及细胞。主要灭菌原理是高温度水蒸气（一 般为 121）作用于细胞一定时间（一般为 20-30 分钟）使细胞蛋白质凝固变性，

8、而造成一切微生物变性死亡，是最为彻底的灭菌方法之一。主要操作技术见教材及实验操作步骤部分。（二）超净工作台的使用1） 依次打开电源开关及工作开关，紫外灯照射 20 min，开启鼓风机运转 10 min，方6图 7 摆斜面图 9 电热干燥箱外观和结构图 8 微孔滤膜过滤器装置构可进行实验操作。2） 将紫外灯切换到照明灯（鼓风机保持运转） ，打开玻璃门（玻璃门开启幅度不能过高，以不超过下巴为宜） ，手臂进入操作台前先点燃酒精灯，再用 75%的酒精棉球擦净工作面，并对手进行消毒。3） 操作时，应在工作台中央无菌区域进行（尽量不要讲话） 。4） 操作完毕后熄灭酒精灯，清理工作台。离开前，关闭工作台工作

9、开关及电源开关，将所有物品归位，并带走废弃物。（三）其他常用灭菌工具五、实验具体操作步骤1. 器皿清洗：将试管、三角瓶、培养皿等玻璃器具清洗干净； 2. 烘干：将经清洗干净的试管、三角瓶、培养皿等玻璃器皿放入烘箱中，并相互之间保持适当间距，以保证烘干效果；打开烘箱电源，设置适当温度（可根据具体情况而定）与时间，进行烘干处理；3. 制作棉塞：按照选取棉花、棉花整理、折角、卷紧、成形、试塞、调整大小等步骤，制作合适棉塞，应使棉塞长度的 1/3 在试管口外，2/3 在试管（或三角瓶）口内。另用量筒或吸管取适量自来水于三角瓶和试管中，包扎好以制备无菌水。4. 包扎：用牛皮纸或旧报纸，一次包扎 710

10、套培养皿，按照裁剪牛皮纸、放置培养皿等玻璃器皿、卷紧、折边、包扎等步骤，包扎好后空培养皿、移液管等，做到美观大方、放置不到、包扎紧密，严防玻璃器皿等露出。5. 灭菌处理：1） 打开电源与开关，检查水位显示灯，视水位显示灯状况，不加或添加适量水（高水位：不必加水；低水位：视情况而定；缺水：必加水；无显示：视情况而定） 。2） 加灭菌物品（注意：物品不能过于密集，否则会影响灭菌效果） 。3） 将锅盖旋到灭菌锅正上方密封处（注意：锅盖用手提着缓慢旋至正上方，不要触及密封圈，造成密封圈破损，也不要将锅盖旋得太高，否则锅盖无法归位至正上方） 。74） 按待灭菌物品的要求，设定温度和时间。5） 进入工作状

11、态后，查看排气（水）阀，将阀门旋至排气处。6） 待有大量白色蒸汽产生时，关闭排气阀，关闭后温度持续上升（注意：在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，灭菌锅内冷空气的排除是否完全极为重要） 。7） 灭菌结束，压力降至 “0”时，打开排气阀，气体排尽后，方可开盖，利用锅内温度烤干棉塞和纱布后再取物。 （注意：压力一定要降到“0“时，才能打开排气阀，开盖取物，否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成棉塞沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者） 。3、其他常见灭菌方式【实验结果】记录自己制作的实验用品（含无菌水）的名称、规格与数量。【注意事项】1. 实验前，熟悉实验

12、室布局，了解实验仪器用品摆放规律及用途；2. 制备无菌水时，试管装水量一般控制在试管高度的 1/53/5，三角瓶装水量不宜超过规格容量的 1/2（装量过多，灭菌过程中易喷出或润湿棉塞） ；3. 灭菌锅的操作安全。【实验思考题】1. 高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？2. 灭菌完毕后，为什么待压力降低至“0”时，才能打开排气阀，开盖取物？3. 在使用高压蒸气灭菌锅灭菌时，怎样杜绝一切不安全的因素？4. 灭菌在微生物实验操作中有何重要意义？8实验二 培养基的配制【目的要求】1. 掌握培养基的配制原理；2. 通过对几种培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。【基本原理】培养基是人

13、工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。培养基的原材料可分为碳源、氮源、能源、无机盐、生长因素和水。本实验通过配制适用于一般细菌、放线菌和真菌的三种培养基来了解和掌握配制培养基的基本原理和方法。培养细菌一般用牛肉膏蛋白胨培养基，它是一种应用十分广泛的天然培养基，其中的牛肉膏为微生物提供碳源、能源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，而NaCl 则提供无机盐。高氏号培养基是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基，此合成培养基含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用而产生沉淀，因此，在混合各成分时，一般按配方要求

14、的顺序依次溶解各成分；此外，合成培养基有的还要补充微量元素，如高氏号培养基中的 FeSO47H2O 的用量仅为 0.001%，在制备培养基时需预先配成高浓度的微量元素贮备液，然后再按一定的量加到培养基中。查氏培养基是用来分离和培养霉菌的合成培养基；麦氏培养基是用来分离和培养酵母菌的半合成培养基。培养基各成分添加完成后，用稀酸或稀碱将其 pH 值调至所需酸碱度，在配制固体培养基时，还要加入一定量的琼脂作为凝固剂。培养基配制完成后，应立即进行灭菌。【实验用品】1. 药品、试剂 牛肉膏，蛋白胨，NaCl，可溶性淀粉，KNO 3，K 2HPO43 H2O，MgSO 47 H2O， FeSO47 H2O

15、，蔗糖， NaNO3，KCl，葡萄糖，KCl，酵母膏，醋酸钠，lmol/L NaOH，lmol/L HCl，琼脂2. 仪器及其它用品 试管，三角瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，天平，牛角匙，pH 试纸，棉花，牛皮纸，记号笔，线绳，纱布，漏斗，漏斗架，胶管等【方法步骤】一、牛肉膏蛋白胨培养基的配制（一）配方：牛肉膏 5g，蛋白胨 10g，NaC1 5g，琼脂 1520g，水 1000mL，pH7.47.6；（二）步骤：1. 称量 按配方计算实际用量后，称取各种药品放入烧杯中。牛肉膏常用玻璃棒挑取，放入小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放入热水中，待牛肉膏与称量纸分离，

16、立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。2. 溶化 在烧杯中加入少于所需要的水量，置放在电热套上，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入己溶9图 10 简易分装器图 11 倒平板方法解的药品中，加热融化，最后补足所失的水分。 3. 调 pH 检测培养基的 pH，若 pH 偏酸，可滴加 lmol/L NaOH，边加边搅拌，并随时用pH 试纸检测，直至达到所需 pH 范围。若偏碱，则用 lmol/L HCl 进行调节。pH 的调节通常放在加琼脂之前。应注意 pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。4. 过滤 液体培养基

17、可用滤纸过滤，固体培养基可用 4层纱布趁热过滤，以利培养的观察。但是供一般使用的培养基，这步可省略。5. 分装 按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗或分装器以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。分装量：固体培养基约为试管高度的 l/5，灭菌后制成斜面。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的 1/3 为宜，灭菌后垂直待凝。6. 加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花（非脱脂棉）制作的棉塞。棉塞的形状，大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。有些微生物需要更好的通气，则可用通气塞。有时也可用硅胶塞、试

18、管帽或塑料塞代替棉塞。 7. 包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。若培养基分装于试管中，则应以 57 支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。然后用记号笔注明，培养基名称，组别，日期。 8. 灭菌 将上述培养基于 121，湿热灭菌 20min。如因特殊情况不能及时灭菌，应放入冰箱内暂存。 9. 倒平板摆斜面 灭菌后，倒平板或制斜面。如制斜面应趁灭菌后未冷却前摆放成斜面，倒平板可放置到需要时，再加热溶化制作。 10. 无菌检查 将灭菌的培养基放入 37恒温培养箱中培养 2448h，无菌生长即可使用，或贮存于冰箱或清洁的橱内，备用。 二、高氏号培养基

19、的配制 （一）配方：可溶性淀粉 20g，KNO3 1g，NaCl 0.5g，K2HPO43H2O 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，FeSO47H2O 0.01g，琼脂 1520g，水1000mL，pH7.47.6。（二）步骤：l. 称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加至少于所需水量的水，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分 FeSO47H2O 可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在 1000mL 水中加入 1g 的 FeSO47H2O，配成浓度为100.01g/mL 的贮备液，再在 100

20、0mL 培养基中加入以上贮备液 1mL 即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2. pH 调节，分装，包扎，灭菌及无菌检查 同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 三、PDA 培养基的配制（一）配方：马铃薯（去皮）200 克，葡萄糖 20 克，琼脂 1520g，水 1000mL，pH 自然（二）步骤：称取洗净去皮马铃薯 200g，切成小块，加水煮烂（煮沸 2030 分钟，能被玻璃棒戳破即可） ，用八层纱布过滤，取滤液，加热，再据实际实验需要加入琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至100

21、0 毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，121灭菌 20-30 分钟左右后取出，试管摆斜面或者摇匀，冷却后贮存备用。【实验结果】记录本实验配制培养基的名称，数量，并说明无菌检查结果，培养基状况及可否使用等。【注意事项】1. 称药品用的牛角匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。2. 培养基配制加热过程中，需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出。3. 灭菌锅操作安全及摆斜面要求。【实验思考题】 1. 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌，若不能及时灭菌应如何处理。2. 已灭菌的培养基应如何进行无菌检查。3. 试设计实验对饮料进行无菌检查。11图 12 土壤梯度稀释操作过程 图 13 平板涂布操作图实验三

22、从土壤中分离微生物及纯化【目的要求】1. 了解学习分离、纯化技术的概念。2. 学习掌握涂布、划线等稀释分离微生物技术。【基本原理】分离就是把成群的菌体一个一个地分开；纯化就是进一步分离，把菌种绝底分成单个菌体的技术。要想从含有多种多样、多姿多态微生物的自然界中获得我们所需的菌（菌株） ，就要通过各种手段方法把一个一个微生物分离开，然后从中挑选出我们所需要的菌株应用于研究或生产之中。分离技术有许多种，下面着重介绍从土壤中通过划线法分离细菌、放线菌、霉菌的技术。【实验用品】1. 药品及试剂 牛肉膏蛋白胨平板、高氏 1 号平板（含 1%酚液 56 滴/L） 、PDA 平板（含80%红酸 1mL/L）

23、 ，土壤样品，无菌水等。2. 仪器及其它用品 接种环，酒精灯，超净工作台等。【方法步骤】取土壤少许，加入一定量的无菌水，制成系列土壤菌悬液。1、涂布法： 1） 取土样 取表层以 下 510 cm 处的 土壤，放入取样袋中，置于 4冰箱中暂存。2） 土样处理 取土样 10 g，迅速倒入带玻璃珠的 90 mL 无菌水瓶中（玻璃珠用量以充满瓶底为宜） ，振荡 1525 min，使土样充分打散。3） 梯度稀释 用 1 mL 的无菌移液管，从中吸取 1 mL 的土壤悬液加入盛有 9 mL 无菌水的试管中，充分混匀，然后用无菌移液管从此试管中吸取 1 mL 加入另一盛有 9 mL 无菌水的试管中，混合均匀

24、，以此类推制成 10-1、10 -2.、10 -3、10 -4、10 -5 等不同梯度的土壤溶液（操作时移液管尖不能接触液面，每一个稀释度换用一支移液管，每次吸入土液后，要12图 14 平板划线法操作图 图 15 平板划线法操作图将移液管插入液面，吹吸 3 次，每次吸上的液面要高于前一次，以减少稀释中的误差） 。4） 涂布 取平板，皿底分别用记号笔写上稀释度，然后用无菌移液管分别从 10-6. 10-5. 10-4 三管土壤稀释液中各吸取 0.1 mL 对号放入已写好稀释度的平板中（从低浓度到高浓度依次取，不用更换移液管） ，用无菌玻璃涂布棒按图 13，在培养基表面轻轻涂布均匀，室温下静置 5

25、10 min，使菌液吸附进培养基。2、划线分离法（在接种室或超净工作台内进行）（1）直线划线法：左手拿平板平皿，盖稍微打开，右手拿接种环，以无菌操作蘸一环土壤菌悬液，在平板 一边划第一道平行线 23 条，转动培养皿约 70 度角，用烧灼过的接种环，待冷却后，接种环从第一道线划过做第二道平行线，同法划第三道平行线，如此划第四道平行线（如图 14、15） 。每种培养基划线一套。（2）曲线划线法：其它操作如同直线法，只是划线是划成曲线。每种培养基划线一套。（3）划线完后，把平皿倒置放在 30下培养，细菌分离要培养 2448h，放线菌分离要培养 57d；霉菌分离要培养 35d。观察生长的菌落（图 5-

26、3） ，再作进一步的分离纯化或直接挑取单个菌落接入斜面培养后保存备用。3、挑取单菌落进一步划线或涂布纯化。【实验结果】记录本实验结束后有无微生物生长，微生物主要种类及菌落形态特征。【注意事项】1、分离纯化操作全过程要在无菌室或超净工作台内进行。2、划线时时，接种环要圆滑；接种环与平板成 45角，用手腕力轻巧地在平面上滑动，避免划破培养基；防止在空间划线。图 17 划线分离出的细菌单菌落13【实验思考题】1、比较细菌、放线菌、霉菌分离菌落的不同。2、划线分离过程中，划完第一道线后再划第二道线时，为什么接种环要在火焰上烧灼冷却后再划线呢？3、试设计从水果（如葡萄或雪梨）中分离酵母菌的实验。14实验

27、四 微生物的接种技术【目的要求】1. 了解学习无菌操作技术； 2. 掌握斜面接种技术。【基本原理】接种就是在灭菌条件下，用接种工具（针、环） （如图 18）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上进扩大培养的技术。接种就是在灭菌条件下，用接种工具（针、环）从一支原菌种中挑取少许菌体，接入到另一支新的培养基上进扩大培养的技术。我们要想得到大量的菌种，适应生产，科研和教学要求，就要进行微生物的接种，扩大菌种数量。接种因使用不同容器、不同的培养基，达到不同的目的，而有不同的接种方法，但是它们的基本要求是相同的。通常接种都应在空气经过消毒灭菌过的“接种室” 、或接种箱或超净工作台内进行。【

28、实验用品】1. 实验材料 苏云金杆菌斜面菌种，牛肉膏蛋白胨斜面培养基等。2.实验试剂 75%酒精或 1： 50 的新法尔天水溶液。3.实验设备仪器 超净工作台，接种针（环） ，接种工具、酒精灯等。【方法步骤】（一）准备工作1接种或接种室使用前半天先擦洗干净，然后每立方米体积用 510 毫升福尔马林盛在容器中加热熏蒸或者是用 1/10 的福尔马林重量的高锰酸钾加到盛有福尔马林的容器中，不用加热，亦可进行熏蒸；也可用 5%的石炭酸喷务灭菌；用紫外灯照射 2030min。也可达到灭菌的目的。应注意，要把接种时要所需的用具（如接种针（环） ，酒精灯等）及培养基放入接种箱（室）一起灭菌消毒，但是菌种不能

29、放入，以免死。超净工作要预先通风，紫外线照射 30min 方可使用。2进入接种室前先把手洗净，再用 75%酒精或新洁尔灭擦两手，菌种试管表面同样要用酒精或新洁尔灭抹擦后才放入接种室（箱内） 。（二）接种技术1、斜面菌种接种技术（从斜面培养基上的菌种接种至另一新的斜面培养基上的方法） 。图 18 接种工具A. 接种环；B.接种针；C.接种钩；D.接种铲；E.F.玻璃涂布器15（1）准备工作就绪后，点然酒精灯。（2）将菌种和斜面培养基的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中，使中指拉于两试管之间的部分，斜面向上，并使它们拉于水平位置，也可将试管放在左手掌中，用手指托住试管。（3）先将棉塞用右手拧转松

30、动，便以接种时拔出。（4）右手拿接种环（拿的方法就和拿钢笔一样） ，在火焰上将环的部分烧红灭菌。环以上凡是在接种时可能进入试管的部分，均应用火烧过（如图 20） 。以下操作都要把试管口靠近火焰旁进行。（5）用右手小指、无名指和手掌拔掉棉塞（如图 20） 。（6）用火焰灼烧管口，灼烧时应不断转动试管口（靠手腕的动作，使试管口沾染的小量菌得以烧死） 。 （如图 20） 。（7）将烧过的接种针（环）触动没有长菌的培养基部分，使其冷却，以免烧死被接种的菌体，然后轻轻接触菌体，取出少许，慢慢将接种针（环）抽出试管（如图 20） 。（8）迅速将接种针（环）在火焰旁无菌区伸进另一试管，在培养基斜面上轻轻划线

31、，在上面接细菌，划线时要由底部划到顶部，由上而上，划线可划之字形，或划几条直线，但都不要把培养基划破，也不要使菌种沾污管壁（如图 20） 。（9）将接种针（环）抽出，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管去迎棉塞，以免试管在运动时纳入不洁空气（如图 20） 。（10）.把针（环）在火焰上再灼红灭菌，放下接种钟（环）后，再腾出手来将塞塞紧。（如图 20） 。（11）全部培养基接种完毕后，要将试管斜面培养基包扎好，并标明姓名、时间和菌种名称；整理好接种室（箱）的台面，搞好清洁卫生。图 19 手持 2 支试管的接种方式图 20 斜面接种时的无菌操作（1）接种灭菌 （2）启开棉塞 （3

32、）管口灭菌 （4）挑取菌落 （5）接种 （6）塞上棉塞162、液体接种技术（由斜面菌接入液体培养基内或液体菌种接入液体培养基）（1）准备工作和操作方法与前相同，但可使试管向上略斜，以免培养液流出。（2）将取得菌种的接种环送入液体培养基时，可使环在液体表面与管壁接触的部分轻轻摩擦。接种后塞棉塞，将试管在手掌中轻轻摇动，使菌体在培养基中分散开来。（3）由液体菌种接种液体培养基时，接种用无菌滴管或移液管，接种量通常为培养液体积的 1/10。无菌操作的注意事项与前相同，只是移液管不同于接种针，系由玻璃做成，它不能在火焰上灼烧，接种前在火焰上迅速通过一两次即可。3、穿刺接种技术（深层柱形固体培养基的接种

33、技术） （如图 21）（1）取两支新鲜半固体牛肉膏蛋白胨深层柱状培养基，做好标记（写上菌种名、接种日期和接种人等） 。（2）接种的方法是，用接种针沾取少量待接菌种，然后从柱状培养基的表面中心穿入其底部（但不要穿透） ，然后沿原刺入路线抽出接种针，注意接种针不要移动。以上接好种的材料置于 30下培养 2448h。【实验结果】培养后取出试管，观察菌种生长情况，检查是否有杂菌生长，评价无菌操作的效果。【注意事项】1、菌种取出后，接种针（环）不要通过火焰、以免烧死菌体。2、斜面接种时，不要使接种针（环）的碰到管壁；不要划破培养基，但也不能在试管空间划，一定要接触到斜面表面上划线接种。3、接种前的准备和

34、接种过程都要有无菌概念。【实验思考题】微生物接种时，通过哪些措施可防止杂菌污染？图 21 斜面穿刺接种17试验五 细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态观察【目的要求】1. 了解枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及毛霉(Mucor) 、根霉(Rhizophs)、曲霉(Aspergillus) 、青霉(Penicillium)、木霉(Trichoderma) 等常见微生物形态构造；2.进一步巩固细菌、霉菌、酵母菌和放线菌的代表种类的菌落特征；3.了解细菌、放线菌、酵母菌、霉菌的繁殖方式及特点。【基本原理】微生物的菌落特征是指微生物在平板上生长，所表现出的群体形态特征。每一种类微生物菌落具有各自相

35、对稳定的特征，例如菌落的大小，菌落边缘形状、隆起形状、表面形态，菌落透明或不透明等。这些特征可用于快速识别、鉴定微生物，在科研和生产实践中常被采用。细菌为单细胞微生物，大小仅为数毫米；放线菌丝状，菌丝直径与细菌相接近；酵母菌为真核细胞；霉菌由菌丝组成，许多菌丝交织在一起形成菌丝体。在固体培养基上长成绒毛或棉絮状。霉菌的繁殖方式多种多样，有无性和有性生殖方式。因此各类微生物较容易区别。【实验用品】1. 实验材料 枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及毛霉、根霉、曲霉、青霉、木霉等常见微生物菌落平板及永久固定装片；2.实验试剂 75%酒精，95酒精 ，乳酸石碳酸棉兰液，蒸馏水等；3.实验设备仪

36、器 载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，酒精灯，显微镜等。【方法步骤】一、观察并比较常见微生物菌落形态依次观察各类微生物平板，注意并记录各种微生物菌落形态特征。二、观察细菌形态结构1.在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用无菌镊子镊取少量菌体于水滴中，用解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻片( 注意不要产生气泡，并不要移动载玻片)。2.先用显微镜低倍镜观察，再转高倍镜及油镜观察。注意观察细胞形状，各部分结构，以及是否有芽孢等。三、观察放线菌菌丝体形态结构1.在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用无菌镊子镊取少量菌丝于水滴中，用解剖图 22 微生物菌落的培养特征18针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻片( 注意不

37、要产生气泡，并不要移动载玻片，以免弄乱菌丝)。2.先用显微镜低倍镜观察，再转高倍镜观察菌丝及孢子器各部分的特征。四、观察酵母菌形态结构1.在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用无菌镊子镊取少量菌量于水滴中，用解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻片 。2.先用显微镜低倍镜观察，再转高倍镜及油镜观察。注意观察细胞形状，各部分结构，以及是否正在进行出芽生殖等。五、观察霉菌菌丝体形态结构1.在洁净的载玻片上滴一滴蒸馏水，然后用无菌镊子镊取少量菌丝于水滴中，用解剖针将菌丝仔细分开，然后盖上盖玻片( 注意不要产生气泡，并不要移动载玻片，以免弄乱菌丝) 。2.先用显微镜低倍镜观察，再转高倍镜观察菌丝及孢子器各部

38、分的特征。附：若需长时间的观察霉菌的形态，可制成永久片，制作方法为：1.在洁净载玻片上滴一滴乳酸石碳酸棉兰液，然后挑取要观察的菌丝少许于染色液中，用解剖针仔细将其分开，然后盖上盖玻片，放置 12 天。2.在制取的片中用阿拉伯胶(或合成树脂、加拿大胶 )将盖玻片四周封好，待凝固后即可进行观察，也可放置起来作为永久片保存。五、观察常见微生物永久装片观察枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、链霉菌、啤酒酵母及毛霉、根霉、曲霉、青霉、木霉等永久装片，尤其注意其是否正在进行分裂及无性孢子、有性孢子繁殖结构及特点。附根霉接合孢子形成的观察：1.取黑根霉 Rh和 Rh菌株分别划线接种于马铃薯培养基平板两侧，置 30恒温箱

39、培养 47 天。2.培养 4 天后，Rh()和 Rh()菌株互相邻近的两个菌丝各向对方生出极短的侧丝，逐渐互相接触，顶端各自膨大并形成横隔，即为配子囊。3.配子囊接触后中间的隔膜消失，二者的细胞质和细胞核互相融合，同时外部形成厚壁，成为接合孢子。4.用水浸片仔细观察接合孢子形成的各个阶段。【实验结果】1、填表比较四大微生物形态特征项目 细菌 放线菌 酵母菌 霉菌含水状态形态颜色透明度菌落与培养基结合程度细胞显微形态气味其它2、按比例绘出常见微生物结构图（不少于 5 种），并图示各部分结构。【注意事项】191、观察平板菌落时，养成良好习惯，最好不要打开培养皿盖。2、制作微生物装片应按实验装片制作

40、规范要求制作，并注意与永久装片进行比较。【实验思考题】设计一个实验，检测实验室空气环境中的微生物类别。20实验六 细菌的简单染色和革兰氏染色【目的要求】1. 学习并掌握细菌的简单染色法；2. 学习并掌握细菌革兰氏染色法。【基本原理】用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。碱性染料的离子带正电荷，能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋白质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷，所以通常采用碱性染料（如美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等）使其着色。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基 pH 下降时，细菌所带正电荷增加，因此易被

41、伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊红美蓝、伊红天青等。简单染色法是只用一种染料使细菌着色以显示其形态，简单染色不能辨别细菌细胞的构造。革兰氏染色法是 1884 年由丹麦病理学家 C.Gram 所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为 G+菌和 G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物

42、易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。【实验用品】1. 实验材料 培养 12-16h 的苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）或者枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） ，培养 24 小时的大肠杆菌（Escherichia coli） （均为活体材料） ；2.实验试剂 结晶紫，卢哥氏碘液，95%酒精，蕃红，复红，二甲苯，香柏油等3.实验设备仪器 废液缸、洗瓶、载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜等【方法步骤】一、简单染

43、色：（1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片的左、右各加一滴蒸馏水，按无菌操作法取菌涂片，左边涂苏云金杆菌，右边涂大肠杆菌，做成浓菌液。再取干净载玻片一块将刚制成的苏云金杆菌浓菌液挑 2-3 环涂在左边制成薄的涂面，将大肠杆菌的浓菌液取 2-3 环涂在右边制成薄涂面。亦可直接在载玻片上制薄的涂面，注意取菌不要太多。（2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。（3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰 2-3 次固定（以不烫手为宜）（4）染色：将固定过的涂片放在废液缸上的搁架上，加复红染色 1-2min。（5）水洗：用水洗去涂片上的染色液（6）干燥：将洗过的涂片放在空气中晾干或用吸

44、水纸吸干。21（7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油一滴，将油镜头浸入油滴中仔细调焦观察细菌的形态。二、革兰氏染色：（1）涂片：涂片方法与简单染色涂片相同。（2）晾干：与简单染色法相同。（3）固定，与简单染色法相同（4）结晶紫色染色：将玻片置于废液缸玻片搁架上，加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色 1 分钟。（5）水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（6）媒染：滴加卢哥氏碘液，媒染 1min。（7）水洗：用水洗去碘液。（8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加 95%乙醇脱色 2025s 至流出液无色，立即水洗。（9）复染：滴加蕃红复染 5min。（1

45、0）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。（11）晾干：将染好的涂片放空气中晾干或者用吸水纸吸干。（12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。（13）实验完毕后的处理：将浸过油的镜头按下述方法擦拭干净，a.先用擦镜纸将油镜头上的油擦去。b.用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头擦 23 次。c.再用干净的擦镜纸将镜头擦23 次。注意擦镜头时向一个方向擦拭。看后的染色玻片用废纸将香柏油擦干净。【实验结果】1、绘出苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的形态结构图； 2、注明三菌的革兰氏染色结果。【注意事项】1、革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，革兰氏阳性菌也可

46、被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短还受图 23 革兰氏染色操作步骤及过程22涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定。2、染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。3、选用幼龄的细菌。G+菌培养 12h-16h，E.coli 培养 24h。若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。【实验思考题】1、作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？其染色成败的关键一步是什么？2、当你对一株未知菌进行革兰氏染色时，怎样能确证你的染色技术操作正确，结果可靠？23实验七 大肠杆菌生长曲线的

47、测定【目的要求】1通过细菌数量的测量了解大肠杆菌的生物特征和规律，绘制生长线。2复习光电比浊法测量细菌数量的方法。【基本原理】大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每 20min 分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期、稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。测定细菌的生长曲线，了解其生长繁殖规律，这对人们根据不同的需要，有效地利用和控制细菌的生长

48、具有重要意义。用于测定细菌细胞数量的方法已在上述实验作了介绍。本实验用分光光度计(spectrophotometer)进行光电比浊测定不同培养时间细菌悬浮液的 OD 值，绘制生长曲线。也可以直接用试管或带有测定管的三角瓶(图 15-5)测定“ klett units”值的光度计。如图156 所示，只要接种 1 支试管或 1 个带测定管的三角瓶，在不同的培养时间(横坐标) 取样测定，以测得的 klett units 为纵坐标，便可很方便地绘制出细菌的生长曲线。如果需要，可根据公式 1 klett units=OD/0.002 换算出所测菌悬液的 OD 值。【实验用品】1菌种 大肠杆菌2培养基 L

49、B 液体培养基 70ml，分装 2 支大试管(5ml/ 支) ，剩余 60ml 装入 250ml 的三角瓶。3仪器或其他用具 722 型分光光度计，水浴振荡摇床，无菌试管，无菌吸管等。【方法步骤】1标记取 11 支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16 和 20h。2接种分别用 5ml 无菌吸管吸取 2.5ml 大肠杆菌过夜培养液(培养 1012h)转入盛有 50ml LB液的三角瓶内，混合均匀后分别取 5ml 混合液放入上述标记的 11 支无菌大试管中。3培养将已接种的试管置摇床 37振荡培养(振荡频率 250r/min)，分别培养0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16 和 20h，将标有相应时间的试管取出，立即放冰箱中贮存，最后一同比浊测定其光密度值。4比浊测定24用未接种的 LB 液体培养基作空白对照，选用 600nm 波长进行光电比浊测定。从早取出的培养液开始依次测定，对细胞密度大的培养液用 LB 液体培养基适当稀释后测定，使其光密度值在 0.10.65 之内( 测定 OD 值前，将待测定的培养液振荡，使细胞均匀分布)。本操作步骤也可用简便的方法代替：