1、人外周血淋巴细胞 RNA 的提取方法一、采集血样，室温保存。使用一次性的抗凝的真空抽血管进行采血。一般使用 EDTA 或肝素抗凝均可；血量一般为 1ml；一般地，1ml 外周血中含有大约 1-2*106 个单个核细胞（PBMC，即淋巴细胞核单核细胞）。二、提取淋巴细胞。取 1.5ml 无菌无酶的离心管，为管 1，先加入 500ul 淋巴细胞分离液；另一个1.5ml 无菌无酶的离心管中，装有 500ul 血样的真空管和 500ul PBS（磷酸盐缓冲液），1：1 混匀的混合物，共 1ml。然后缓慢把混匀的血样 PBS 混合液加入到有淋巴细胞分离液的管 1 中，注意要缓慢，使血样尽量位于提取液上层
2、，不能太用力让血细胞扩散到下层，就没办法离心分层了。（这一步的操作应该尽量快速的完成，因为时间长了，红细胞就会在重力作用下沉降，混入到提取液中，对后面的离心造成影响）然后离心。1500rpm,15min,20 摄氏度。说明：1、从采集血样到开始实验的时间最好不超过 4 小时。实验过程中一直保持室温条件，一般 20 摄氏度比较适中，因为细胞的最适温度是体温 37 摄氏度，但是温度降低又可以降低细胞的代谢，两者有些矛盾，所以取中间温度比较理想。2、关于淋巴细胞分离液的注意事项：启封后应置 4保存避免微生物的污染；分离液从冰箱取出后，不可立即使用，需待溶液温度升至室 温时，摇匀后使用； 整个分离过程
3、中，温度应控制在 18-28且在无菌环境下，避免微生物的污染，否则会影响分离质量；未启封前在 18-25避光保存，启封后置 4保存，本品为真空包装，未启封前置于 10 以下易出现白色结晶，影响分离效果。（各种淋巴细胞分离液的保存温度不完全一致）淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂，为带有乳光或微乳光的灭菌水溶液，主要成分是葡聚糖与 泛影酸葡甲胺。适用于人淋巴细胞和大多数哺乳动物细胞的分离纯化，能除去红细胞和死细胞碎片，所获得的 PBMC 可进一步用于原代培养或流式细胞分析。最常用的细胞分离液有 Ficoll 和 Percoll。3、转数为
4、 1500rpm，时间范围为 15 分钟，温度为室温 20 摄氏度。推荐两步离心法：首先用 1500rpm/min离心 15min，如果白膜层足够一步就结束，如果发觉细胞不够，说明该病人的淋巴细胞比重较低，再重新用 1500rpm /min 离心 15min。三、离心后，分四层。淋巴细胞位于第二层（从上到下），呈白蒙蒙的一薄层。用移液器（200ul 档）吸取分离液层中的淋巴细胞，这里技巧性比较强，需要多 次练习才能比较熟练的把淋巴细胞吸的比较完全，大约可得到 400ul 的液体。把吸取的淋巴细胞溶液装入另一无菌离心管中。加入 1mlPBS 缓冲液到离心管中，1500r,15min，20 摄氏度
5、。把离心后的上层液体倒掉，重复离心步骤至液体无明显红色（即红细胞数量很少），淋巴细胞位于离心管底的一小点白色的物质，一般会混有少量红细胞，尽量避免。说明：1、洗涤后离心的条件，通常用 1500rpm 就足够了，太高了容易把细胞离死。时间为 15min，温度还是室温 20 摄氏度。2、离心后，看到淋巴细胞中混有少量红细胞，在这个实验中问题不大。3、洗涤液的选择也是平衡盐溶液即可，作用主要是去除淋巴细胞中的血浆蛋白和血小板，红细胞很难去掉。一般洗涤液 PBS 用 3ml 即可。四、用 Trizol reagent 裂解淋巴细胞，提取 RNA。在离心管中加入 1ml Trizol 试剂，可以裂解除
6、RNA以外的其他大分子物质，细胞膜，细胞器等。这个东西有致癌、致畸性，要带口罩，小心操作。用加液枪吹打离心管底部的淋 巴细胞团块，把其打散。一般至少吹打 30-60 次，主要目的是把其打散，让 Trizol试剂充分裂解淋巴细胞。把吹打之后的液体转移到冻存管中，标记，浸泡进液氮（这一步的目的是快速冻存 mRNA），一到两小时以后，转存在 -80 摄氏度冰箱中。五、外送说明：1、TRIZOL 试剂是直接从细胞或组织中提取总 RNA 的试剂。它在破碎和溶解细胞时能保持 RNA 的完整性。2、在 TRIZOL 中，RNA 是隔离在 RNA 酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无 RNA 酶的非一次
7、性的玻璃器皿或塑料器 皿。玻璃器皿可以在 150C 的烘箱中烘烤 4 小时。塑料器皿可以在 0.5 M NaOH 中浸泡 10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。当 TRIZOL 用量少于 2-ml 时建议使用清洁的一次性的聚丙材质试管。3、最后用于装裂解细胞的冻存管请购买无菌无酶的冻存管。BioTNT 相关产品：1、 淋巴细胞分离液，200ml，130 元；2、10PBS, 250ml， BioTNT，60 元；3、 Trizol， 100ml， invitrogen，1600 元；（BioTNT 提供分装产品，400 元/20ml）4、 1.5ml 冻存管，无色可立，已灭菌，有盖，Axygen，100 支/包，1355、 无菌 RNase-free eppendorf 管(1.5ml)，Axygen，1000 支/包，91
