1、 莪芪抗瘤方剂诱导白血病 HL-60 细胞凋亡的血清药理学研究【摘要】 目的 研究中药复方莪芪抗瘤方剂在体外对白血病 HL-60细胞凋亡的作用,并探讨凋亡发生与细胞内 Ca2+、Caspase-3、Bcl-2的关系。方法 通过血清药理学方法,选择 10%浓度的含药血清与白血病 HL-60 细胞共同培育 24、48、72、96 h 后,应用荧光显微镜观察细胞形态,流式细胞仪检测凋亡峰(亚二倍体峰), 用 Fura-2 荧光负载方法测定细胞内 Ca2+浓度的变化。比色法检测凋亡相关基因Caspase-3 活性变化。亲和免疫组化 LSAB 法检测 HL-60 细胞 Bcl-2基因表达。结果 10%浓
2、度的含药血清处理组细胞体积缩小,细胞核固缩,膜起泡,核断裂及形成凋亡小体等,以 72 h 最为明显；可见 DNA含量低于 G1 期的凋亡细胞群,这群细胞的凋亡百分率随时间的递增而增加。10%浓度的含药血清处理组的细胞内 Ca2+浓度也明显高于对照组(P0.01),Caspase-3 浓度明显高于对照组(P0.01),Bcl-2 基因表达明显低于对照组(P0.05)。结论 莪芪抗瘤方剂含药血清诱导白血病 HL-60 细胞发生凋亡,这种变化可能与细胞内Ca2+、Caspase-3 水平上调及 Bcl-2 表达下调有关。 【关键词】 莪芪抗瘤方剂；白血病；Caspase-3；Bcl-2Abstrac
3、t：Objective To explore the apoptotic effect of Eqi compound prescription (contained-herb serum) on cute myelocytic leukemia HL-60 cell, which is relative to intracellular Ca2+, Caspase-3 and Bcl-2. Methods According to serum pharmacology, HL-60 cells were exposed to 10% concentrations of contained-h
4、erb serum for 24, 48, 72 and 96 hours respectively. Cells were observed under a fluore- scence microscope. SubG1 DNA was examined by flow cytometer. Intracellular Ca2+ concentration was measured by fura-2 fluorescence load method. Caspase-3 enzymatic activity were measured by colorimetry. Bcl-2 gene
5、 expression were measured by LSAB. Results The contained-herb serum could induce apoptosis of HL-60 cells. Intracellular Ca2+ concentration of treatment with Eqi was higher evidently than that of control (P0.01). Caspase-3 gene expression of treatment with Eqi was higher evidently than that of contr
6、ol (P0.01). Bcl-2 gene expression of treatment with Eqi was lower evidently than that of control (P0.05). Conclusion According to serum pharmacology, Eqi compound prescription could induced apoptosis of acute myelocytic leukemia HL-60 cell, which is relative to up-regulating Ca2+, Caspase-3 and down
7、-regulating Bcl-2.Key words：Eqi compound prescription；acute myelocytic leukemia； apoptosis； Caspase-3；Bcl-2 越来越多的研究表明,细胞内 Ca2+水平升高与诱发细胞凋亡密切相关1。细胞内凋亡相关基因 Caspase-3 活性变化对凋亡的诱导起重要促进作用2。Bcl-2 是重要的抑凋亡基因之一,过度表达 Bcl-2 的急性白血病细胞抑制凋亡3。本实验主要观察莪芪抗瘤方剂(含药血清)对白血病 HL-60 细胞内Ca2+浓度、促凋亡基因 Caspase-3 活性及抑凋亡基因 Bcl-2 表达的影
8、响,探讨其可能的作用机制。1 材料与方法1.1 动物日本大耳白兔,雄性,体重 2.53 kg,兰州医学院实验动物室提供。1.2 药物莪芪抗瘤方剂由莪术、三棱、黄芪、女贞子等药物组成,甘肃省药材公司饮片厂提供,按工艺制成每 1 mL 含原药材 5 g 的浸膏,4 保存备用。1.3 含药血清的制备以纯种雄性日本大耳白兔 10 只,每日给予含莪芪抗瘤方剂浸膏 10 g/kg 灌胃,另设 3 只为对照组(生理盐水组)。连续 10 d,于最后一次灌药后 1 h(灌药前禁食、不禁水 12 h),心脏采血并分离血清,经56 、30 min 灭活,无菌过滤后 ,置-20 冰箱保存备用。1.4 细胞培养HL-6
9、0 细胞由兰州医学院血液病研究所传代保存,采用常规培养。培养液为含 10%的小牛血清,青、链霉素各 100 U/mL 的 RPMI-1640,在 37 、饱和湿度、 5% CO2 孵箱中培养,每 23 d 换液传代培养。1.5 细胞形态学观察参照文献4方法略加改动,将细胞以 1104 接种于 96 空板中,24 h 细胞贴壁后,弃上清。加入 10%的含药血清培养基处理细胞,另设未加药对照组。每 12 h 收集对照及药物处理组细胞,离心涂片,用无水乙醇固定 10 min 后 ,加 1.2 g/mL 吖啶橙染色 30 min,于荧光显微镜下观察细胞染色质及 RNA 变化并拍照。1.6 流式细胞术分
10、析参照文献5略加改动,离心收集 1105 个细胞,将细胞悬于 200 L 冷 PBS 中,冰冻的体积分数为 70%的乙醇 2 mL 于 4 固定 24 h,离心收集细胞,重悬于 500 L PBS,另加入 RNA 酶(100 mg/mL), 0.1%Triton X-100 缓冲液,37 孵育 30 min, 4 ,50 mg/mL 碘化丙锭染色 30 min,流式细胞仪 (EPICS XL；Coulter,USA)检测 DNA 含量。1.7 细胞内 Ca2+浓度测定 参照文献6 方法进行。用 100 mL 培养瓶 ,接种 5105 个细胞/瓶,药物处理 24 h 后,每 12 h 收集对照及
11、药物处理组细胞,用胰蛋白酶消化,两瓶细胞收集成一组,每组调整细胞浓度 1.5106 个细胞/mL, 用含 0.2 牛血清白蛋白(BSA) 的 RPMI-1640 培养液 3 mL 制成细胞悬液。设定发射波长 500 nm,光栅 10 nm,在 37 下用激发波长为 340 nm 和 380 nm 测定自发荧光；加 Fura-2/AM(终浓度为 1.67 g/mL)5 L,37 恒温振荡 45 min；加 Fura-2/AM 扩散入细胞膜后其脂溶性基团 AM 被酯解 ,释放出 Fura-2, Fura-2 最大激发波长为 380 nm,而与细胞内游离 Ca2+结合后最大激发波长移至 340 nm
12、,离心,去上清,用 HBSS-BSA 缓冲液洗涤 2 次,加 3 mL HBSS-BSA 缓冲液制成细胞悬液 ,用上述 2 个激发波长测定负载Fura-2 的荧光强度；然后加 Triton X-100 15 L 裂解细胞,测这 2 个激发波长的最大荧光强度,最后加 0.1 mol/L EGTA(pH 8.7)500 L 络合Ca2+测这 2 个激发波长的最小荧光强度。根据文献6制定的公式计算细胞内 Ca2+浓度。1.8 Caspase-3 活性检测分别收集诱导组、未诱导组 2106 个细胞,1000 r/min5 min,弃上清。将细胞重新悬浮于 50 L 冷细胞裂解缓冲液中,冰上放置 10
13、min。4 下 12 000 r/min 离心 10 min,以去除细胞碎片。将上清转移至另一微离心管中,置于冰上。每组加入 50 L 的 2反应缓冲液/DTT 混合液。每管加入 5 L 的 1 mmol/L Caspase-3 底物(DEVD-pNA,终浓度 50 mol/L)。水浴 37 孵育 1 h。设立一个平行管不加底物,在 405 nm 波长下读取 OD 值。根据试剂盒说明所得斜率值(OD/nmolpNA)计算 Caspase-3 活性单位。Caspase-3 活性单位=(诱导组 OD-未诱导组 OD)/斜率 1.9 Bcl-2 基因表达测定 亲和免疫组化 LSAB 法检测 10%的
14、含药血清处理组和未加药对照组的 HL-60 细胞 Bcl-2 基因表达,胞浆染为棕黄者为阳性细胞,油镜下随机计数 300 个细胞,计算阳性细胞数。1.10 统计学方法数据以 xs 表示,用 SPSS10.0 软件进行组间 t 检验。2 结果2.1 荧光显微镜观察结果 莪芪抗瘤方剂(10%含药血清)经处理 HL-60 细胞 24、48、72、96 h 后,吖啶橙(AO) 荧光观察可见,表现凋亡细胞的特征性形态变化：细胞体积缩小,细胞核固缩,膜起泡,核断裂及形成凋亡小体等,以 72 h 最为明显。2.2 流式细胞仪分析 HL-60 细胞 DNA 含量 莪芪抗瘤方剂(10% 含药血清 )经不同时间处
15、理后,可见 DNA 含量低于 G1 期的凋亡细胞群,这群细胞的凋亡百分率随时间的递增而增加。对照组凋亡率 4.7%,莪芪抗瘤方剂(10% 含药血清)分别处理 HL-60 细胞 48、72 h后, 凋亡率分别为 13.2%、23.1%。2.3 细胞内 Ca2+浓度测定(见表 1)表 1 10% 含药血清作用于 HL-60 细胞不同时间细胞内 Ca2+浓度检测结果 (略)注：组间比较,P0.01( 下同)。2.4 Caspase-3 活性测定(见表 2)表 2 10% 含药血清作用于 HL-60 细胞不同时间对Caspase-3 活性的影响(略)2.5 Bcl-2 基因表达测定(见表 3)表 3
16、10% 含药血清作用于 HL-60 细胞不同时间对Bcl-2 表达的影响 (略)3 讨论20 世纪 80 年代中期,Iwama H 等7提出的“血清药理学”方法实现了体外与体内实验的结合,其实验结果与体内实验有较好的一致性。笔者采用该法对莪芪抗瘤方剂诱导 HL-60 细胞凋亡进行了实验研究。通过荧光染色、流式细胞仪分析测试发现,莪芪抗瘤方剂 10%含药血清具有诱导白血病 HL-60 凋亡的作用,这种作用呈时间依赖性；细胞内游离 Ca2+的动态变化在诱发凋亡机制的多个方面起重要作用；Ca2+作为第二信使参与磷脂酰肌醇系统、钙调蛋白系统或线粒体/细胞色素 C 介导途径的凋亡信号传递；作为金属辅助因
17、子激活钙依赖性的核酸内切酶,使 DNA 降解或激活转录因子而参与凋亡的基因表达。在凋亡程序启动及执行过程中,称为凋亡效应器的 Caspases 蛋白酶家族起了非常重要的作用,直接参与凋亡早期启动,凋亡信号的传递以及凋亡晚期作用于不同凋亡底物,产生细胞皱缩、膜出泡、DNA 断裂等凋亡特征现象8。调亡的发生发展是受基因调控的,在参与调控的多种癌基因和原癌基因中,原癌基因 Bcl-2 是抑制细胞凋亡的主要基因之一,Bcl-2 高表达可延长白血病细胞存活时间,抑制凋亡9。本研究结果显示,莪芪抗瘤方剂 10%含药血清在诱导人类早幼粒白血病细胞株 HL-60 凋亡过程中,细胞内游离 Ca2+水平明显升高、Caspase-3 活性增加、Bcl-2 表达下调；表明其含药血清诱导 HL-60凋亡可能依赖于细胞内 Ca2+、Caspase-3 水平上调,Bcl-2 表达下调。【
