1、键入文字 生物信息学结课论文 键入文字1番茄 WRKY26 基因的生物信息学分析摘要：番茄(Lyeopersicon escaleutum.Mil1)是世界上重要的蔬菜作物之一，已经成为蔬菜基因工程研究的模式植物之一。由于环境污染，气候条件不断恶化，使地球上的生物生存环境遭受到越来越严重的危害，因此番茄非生物抗逆性改良的研究工作就更显得迫切和重要。已有研究证明 WRKY 转录因子可参与多种植物抗性反应, WRKY26 基因存在于番茄中，其编码的 WRKY26 转录因子对番茄抗旱性有重要调控作用，研究其生物学功能显得尤为重要。本文采用生物信息学的方法对已在 GenBank 上登录的番茄 WRKY
2、26 基因的核酸及氨基酸序列、组成成分、同源性比对、编码蛋白质的理化性质、信号肽、跨膜结构域、亲、疏水性、蛋白质结构及功能域等进行预测和推断。结果表明：该基因的ORF 长度为 1608bp 且与马铃薯 STWRKY8 同源性很高，该基因编码的蛋白质分子量为分子量为 59624.9， 等电点为 6.87，为酸性疏水性蛋白质，且不稳定。该蛋白质无信号肽和跨膜结构域，属于非分泌蛋白质。蛋白质结构表明该蛋白主要为 转角和无规则卷曲，没有 螺旋。通过此次研究，希望为今后深入研究该类基因的功能和结构特征提供依据。关键词：番茄；WRKY26 基因；蛋白质功能；同源性前言番茄基因组中,数目众多的转录因子参与植
3、物的生长发育、物质代谢、响应生物和非生物胁迫等多种生物进程。WRKY 基因家族是植物重要的转录因子家族,在抗病信号转导途径中起重要调控作用,因而成为分子植物病理研究领域中的热点。WRKY 转录因子是一类植物所特有的抗逆相关转录因子超家族，在植物生物、非生物胁迫 1以及植物的生长发育和多种代谢途 2的调控中起重要作用。近年来的研究发现,转录因子和抗逆基因会对环境胁迫作出响应。一个抗逆基因的超表达只能提高植物单一抗性,而一个转录因子基因的超表达能够激活多个下游抗逆基因的表达,从而提高植物综合抗逆能力。所以与单抗基因相比,转录因子已成为作物改良的研究热点。尤其是 WRKY 转录因子,因其可显著地调控
4、植物生物和非生物胁迫,更是备受关注 3。 WRKY 家族中的大部分成员受到水杨酸(SA)、NaCl、低温等刺激后会诱导表达 4-6。 Qiu 等 7发现 OsWRKY45 可在病原菌的诱导下表达,并提高转基因拟南芥的抗病性,说明 WRKY 基因还具有潜在的抗病能力。现已证明 WRKY 可参与多种植物抗病反应 8。番茄作为重要的模式植物周年生产中常受到高盐、低温、病原菌的影响,其遗传改良越来越受到重视 9。所以研究 WRKY26 基因的生物信息学功能显得尤为重要，可以为转基因番茄等其他遗传操作提供技术储备。 一.基因的查找，在 NCBI 中查找基因序列mRNA sequence键入文字 生物信息
5、学结课论文 键入文字2gi|723709376|ref|XM_004241707.2| PREDICTED: Solanum lycopersicum probable WRKY transcription factor 26 (LOC101255501), mRNAGTATCTTCTTTCTTTTAATGGCTGCTTCAAGTTTCTCTTTTCCCACTTCATCTTCTTCATTCATGACGACTTCTTTCACCGACCTTCTTGCTTCTGATGATTATCCAACCAAAGGACTTGCTGATAGAATTGCAGAGAGGACTGGTTCTGGAGTTCCTAAATTCAA
6、ATCTCTTCCACCTCCTTCACTTCCATTATCGCCTCCTCCTTTTTCGCCTTCCTCTTACTTTGCTATTCCTCCTGGTTTAAGTCCAACTGAACTTTTAGACTCCCCTGTTCTTTTGTCTTCTTCAAACCTTCTTCCATCTCCGACGACTGGGAGTTTTCCATCTCGTGCTTTTAATTGGAAGAGCAGTAGTCATCAGGATGTGAAACAGGAAGACAAAAACTACTCAGATTTTTCTTTCCAGCCTCAAGTAGGGACAGCTGCATCATCAATCTCTCAATCTCAAACTAACCATGTCCCTCT
7、GGGGCAGCAAGCATGGAATTGTCAAGAGCCCACAAAACAGAATGATCAAAATGCTAATGGAAGATCCGAATTCAACACTGTACAGAATTTTATGCAGAATAATAATGATCAGAACAATAGTGGAAACCAATACAATCAGAGTATAAGGGAGCAGAAAAGGTCAGATGACGGATACAATTGGAGGAAATACGGGCAGAAACAAGTAAAAGGTAGTGAAAATCCGAGAAGCTACTACAAGTGTACATACCCAAATTGTCCCACCAAGAAGAAGGTTGAGAGATCTTTAGATGGTCAAATTAC
8、TGAAATTGTGTACAAGGGTAATCACAACCATCCAAAGCCTCAGTCTACCAGAAGATCGTCATCATCCACAGCTTCATCTGCATTCCAATCTTACAATACACAAACTAATGAAATTCCAGATCATCAATCCTATGGTTCAAATGGACAAATGGATTCCGTTGCAACACCTGAGAATTCTTCGATTTCATTTGGGGATGATGATCATGAACACACTTCTCAAAAGAGTAGTAGGTCAAGAGGAGATGATCTTGATGAAGAGGAACCAGACTCAAAAAGATGGAAAAGAGAAAACGAAAGTGA
9、AGGTGTATCTGCACTAGGAGGGAGTAGGACAGTTAGAGAACCTAGAGTTGTAGTTCAAACTACGAGTGACATCGATATCCTAGATGATGGTTATAGATGGAGGAAGTATGGTCAAAAAGTAGTGAAAGGAAATCCTAATCCCAGGAGCTACTACAAATGCACAAGTACGGGATGTCCAGTAAGAAAACATGTGGAAAGGGCATCACAAGACATAAGGTCAGTGATAACAACCTATGAAGGGAAGCACAACCATGATGTTCCAGCAGCAAGGGGCAGTGGCAACCACTCAATTAACCGACC
10、TATGGCACCGACCATAAGGCCTACTGTGACATCTCATCAATCCAACTATCAAGTTCCATTACAAAGTATAAGGCCACAACAGTCTGAAATGGGAGCACCCTTTACACTAGAGATGTTGCAGAAGCCTAATAATTATGGTTTCTCAGGATATGCAAATTCAGGGGATTCATATGAAAACCAAGTTCAGGACAATAATGTGTTTTCGAGAACTAAGGACGAGCCTCGAGATGACTTGTTTATGGAGTCATTGCTTTGCTGAAACTGGAATCCTAGAAAGGAGCACGAATTGAAGTTTATGAA
11、ACGAAAAACTGAACCTTTTATTTATTTATTTTTGCATAAAGAATATGATAGGAAGCATTTTGATTTCATTTGTTAATAGATCATATACTGTTTTTTTTTTTGGTGTGTGTACATTTTGTACTAGGAAATTTGTTTGTTGTAAATTCAATCAAATGCGGTGTAGATGTTCATGCAGTTACCACTGTTATGGGGGTTATATAATTTAGGATAGGAATGTAAATCCCCAACTCATGACTATATGACACTGATTCTTTATTTCTATCACATTTTCAAGTTTTATATATTAAAGAAGATTGCAGT
12、TTTTCAAProtein sequencegi|460392301|ref|XP_004241755.1| PREDICTED: probable WRKY transcription factor 26 Solanum lycopersicumMAASSFSFPTSSSSFMTTSFTDLLASDDYPTKGLADRIAERTGSGVPKFKSLPPPSLPLSPPPFSPSSYFAIPPGLSPTELLDSPVLLSSSNLLPSPTTGSFPSRAFNWKSSSHQDVKQEDKNYSDFSFQPQVGTAASSISQSQTNHVPLGQQAWNCQEPTKQNDQNANGRSEFN
13、TVQNFMQNNNDQNNSGNQYNQSIREQKRSDDGYNWRKYGQKQVKGSENPRSYYKCTYPNCPTKKKVERSLDGQITEIVYKGNHNHPKPQSTRRSSSSTASSAFQSYNTQTNEIPDHQSYGSNGQMDSVATPENSSISFGDDDHEHTSQKSSRSRGDDLDEEEPDSKRWKRENESEGVSALGGSRTVREPRVVVQTTSDIDILDDGYRWRKYGQKVVKGNPNPRSYYKCTSTGCPVRKHVERASQDIRSVITTYEGKHNHDVPAARGSGNHSINRPMAPTIRPTVTSHQSNYQVPLQSIRP
14、QQSEMGAPFTLEMLQKPNNYGFSGYANSGDSYENQVQDNNVFSRTKDEPRDDLFMESLLC二开放阅读框(ORF)的查找开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)是基因序列中的一段无终止序列打断的碱基序列，可编码相应的蛋白。在没有其它信息的前提下，DNA 序列可能按六种框架阅读和翻译(每条链三种，对应三种不同的起始位点)。ORF 识别包键入文字 生物信息学结课论文 键入文字3括检测这六个阅读框架并决定哪一个包含以启动子和终止子为界限的 DNA 序列而其内部不包含启动子或终止子，符合这些条件的序列有可能对应一个真正的单一的基因产物。ORF 的识别是证
15、明一个新的 DNA 序列为特定的蛋白质编码基因的部分或全部的先决条件。使用 ORFfinder 查找番茄 WRKY26 基因开放阅读框，这里使用默认参数，结果如图 2.1 所示。图 2.1WRKY26 的 ORF 预测结果结果表明：如图 2.1 显示了 ORF Finder 预测结果，给出了 6 个阅读框中可能的 ORF 图示、编码相位、位置及长度，这是根据六种不同的编码方式得到的（包括正反链） 。从预测结果可以看出，一个 DNA 序列可能有多个 ORF。相对而言，一段连续较长的 ORF 比较短的 ORF 更可能是编码序列。图中第三条（紫色标注）为该基因的开放阅读框，其从 18 号碱基到 16
16、25 号碱基，长度为 1608bp。在上述 mRNA 序列中使用灰色底纹标注出开放阅读框序列。三引物的设计用 Primer 5.0 设计引物，根据实验需要（巢氏 PCR） ，设计内侧引物和外侧引物。并且在内侧引物两端加入酶切位点，分别为 XbaI ，SacI 酶切位点。表 3.1 引物序列名称 引物序列SlWRKY31-F1 CCCATTGCACTCTTGTATCTTSlWRKY31-R1 TCAATTCGTGCTCCTTTCTAGSlWRKY31-F2 TCTAGAATGGCTGCTTCAAGTTTCTC (XbaI)SlWRKY31-R2 GAGCTCTCAGCAAAGCAATGACTCC
17、 (SacI)图 3.1 外侧引物设计键入文字 生物信息学结课论文 键入文字4图 3.2 内侧引物设计四同源性比对使用 Blastn 进行序列对比，选用 RNA 数据库，限定物种为番茄，其他参数默认，只有一条序列。图 4.1 限定物种 Blast 结果条件改为不限定物种，其他参数默认键入文字 生物信息学结课论文 键入文字5图 4.2 不限定物种 Blast 结果图 4.3 不限定物种 Blast 结果五同源性分析下载不同物种与番茄 WRKY26 的同源蛋白质序列，共计 7 条，使用MEGA5.1 制作进化树。使用 Pairwise blastp、emboss_needle、emboss_wat
18、er程序比对上述氨基酸序列中的两条，其中均使用 EBLOSUM62 矩阵。表 5.1 蛋白质序列名称 登录号番茄（Solanum lycopersicum） XP_004241755.1 马铃薯（Solanum tuberosum） NP_001274836.1烟草（Nicotiana sylvestris） XP_009790461.1白梨（Pyrus x bretschneideri） XP_009372253.1苹果（Malus domestica） XP_008350560.1芝麻（Sesamum indicum） XP_011095229.1甜菜（Beta vulgaris） XP_
19、010685944.1键入文字 生物信息学结课论文 键入文字6表 5.2 氨基酸序列比对程序 得分值 一致性 相似性 空位 Pairwise blastp 1074 522/537(97.0%) 528/537(98.0%) 3/537(0%) emboss_needle 2771.5 522/537(97.2%) 528/537(98.3%) 3/537(0.6%)emboss_water 2771.5 522/537(97.2%) 528/537(98.3% 3/537(0.6%) Solanum lycopersicumSolanum tuberosum Nicotian sylvest
20、ris Beta vulgaris ubsp. vulgarisMalus domestica Sesamu indicum Pyrus x bretschneideri91073410.1图 5.1 进化树如图 5.1 所示：1) 同属于茄科的马铃薯、番茄和烟草聚成一个亚类，这说明它们的亲缘关系很近，其中番茄和马铃薯的同源性极高。2) 甜菜和番茄尽管在一个类群，但是甜菜在外侧，说明它们亲缘关系较远。3) 从表 5.2 也可以看出番茄 WRKY26 基因编码的蛋白质和马铃薯 STWRKY8 基因编码的蛋白质的相似度非常高，说明两个基因的同源性很高，与进化树分析结果相同六.蛋白质理化性质分析使用
21、 ExPASy - ProtParam tool 分析氨基酸序列。表 6.1 氨基酸组成氨基酸 数量 比例 氨基酸 数量 比例Ala (A) 21 3.9% Arg (R) 30 5.6%Asn (N) 39 7.3% Asp (D) 33 6.2%Cys (C) 6 1.1% Gln (Q) 37 6.9%Glu (E) 26 4.9% Gly (G) 32 6.0%His (H) 12 2.2% Ile (I) 15 2.8%Leu (L) 24 4.5% Lys (K) 28 5.2%Met (M) 8 1.5% Phe (F) 19 3.6%Pro (P) 42 7.9% Ser (S
22、) 78 14.6% Thr (T) 34 6.4% Trp (W) 5 0.9% Tyr (Y) 21 3.9% Val (V) 25 4.7%Pyl (O) 0 0.0% Sec (U) 0 0.0%键入文字 生物信息学结课论文 键入文字7表 6.1 氨基酸序列 ExPASy 分析结果结果分析：1） 总的亲水性平均系数(GRAVY) 为-1.062,由于总的亲水性平均系数可以体现蛋白质的亲疏水性质，数值越大代表亲水性越强，越低代表越弱。由于-1.062 0.8002 : 0.800 diff 0.6003 : 0.600 diff 0.4004 : 0.400 diff 0.2005 :
23、0.200 diff键入文字 生物信息学结课论文 键入文字113）综合上述分析，P07597 和 P35334 蛋白具有信号肽，P13086 位于线粒体内。十一.蛋白质三级结构分析蛋白质的生物学功能是由高级结构决定的。对蛋白质高级结构的预测和分析，有助于理解蛋白质结构与功能之间的相关性。使用 SWISS PDB Viewer 分析该蛋白质序列的三级结构。图 11.1 蛋白质三维结构图结果表明:该蛋白质有 5 个 转角区域以及一些无规则卷曲，没有 螺旋区域。参考文献1 Pozueta-romero J,HOULNEG,CANAS L,et al.Enhanced regener-ation of
24、 tomato and pepper seedling explants for Agrobacterium-mediated transformationJ.Plant Cell Tissue and Organ Culture,2001,67:173-180.2 Van Roekel J S C,Damm B,Melchers L S,et al.Factors influencing transformation frequency of tomatoJ.Plant Cell Rep,1993,12:644-647.3 Qiu Y P,Jing S J,Fu J,et al.Clonin
25、g and analysis of expression profile of 13SIWRKYgenes in riceJ.Chinese Science Bulletin,2004,49 (20):1860-1869.4孙晓春，高永峰. 番茄 SIWRKY23 基因的克隆及其抗病性和耐盐性分析J.中国农业学报，2014，16（5）：39-465McCormick S, Niedermeyer J. Leaf disctransformation of cultivated tomato usingAgrobacterium tumefaciensJ.PlantCellRep. 1986,
26、(5): 81-846Sanford J C,Reisch B I,Reisch B I.Attempted pollen-mediated plant transformation employing genomic donor DNAJ.Theoretical and Applied Genetics,1985,69:571-574.7 Qiu Y P,Yu D Q.Over-expression of the stress-induced OsSIWRKY45 Arabidopsis键入文字 生物信息学结课论文 键入文字12J.Environmentaland Experimen-tal
27、 Botany,2009,1(65):35-478 赵红英,祝建波,王爱英,等.HARDY 基因植物表达载体的构建及在番茄中的遗传转化J.西北农业学报,2009,18(5):232-2369 Hightower,Earle ED.An examination of factors affecting the efficice-ncy of Agrobacterium-mediated transformation of tomatoJ.Plant Cell Re-ports, 1996,16:235-240.附录：检索工具表 12.1 检索工具表功能 网址BLAST 检索 http:/www.
28、ncbi.nlm.nih.gov/blast开放阅读框分析 http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi同源性分析 Pairwise blastp http:/blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi同源性分析 emboss_needle https:/www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/同源性分析 emboss_water https:/www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_water/蛋白质序列理化性质分析 http:/web.expasy.org/protparam/信号肽分析工具 http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-3.0/跨膜区域分析 http:/www.sbc.su.se/miklos/DAS/ 蛋白质三级结构预测 http:/swissmodel.expasy.org/ 蛋白质结构与分析 http:/prosite.expasy.org/scanprosite/蛋白质亲疏水性分析 http:/web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscal/本地生物信息学分析软件:MEGA5.2、Primer5.0、SWISS PDB Viewer
