1、高效液相色谱应用实例,柱后pH调节电导检测,对有机酸具有高选择性和高灵敏度,有机酸分析系统流程图,1、2 泵 3 进样器4 柱温箱5 电导检测器6 数据处理机 7 混合室 8 柱子9 流动相10 缓冲液,分析条件,分离条件色谱柱：Shim-pack SCR-102H(8mmI.D300mmL.)1个或2个分析柱连接 保护柱 SCR-102H (6mmI.D.50mmL.) 流动相：5mM p-甲苯亚磺酸水溶液 流量 ：0.8mL/min 温度 ：40或45 检测条件 缓冲液：20mM Bis-tris 水溶液含 5mM p-甲苯亚磺酸和100 EDTA 流量 ：0.8mL/min 检测器：电导
2、检测器 polarity;+,样品的分析实例,食品 啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等 体液 血清，尿等 医药品 肾的透析液，钙制剂等 发酵 微生物培养液，酸奶等 环境 工厂废水等,有机酸标准品的色谱图1,一个分析柱1. 磷酸2. 柠檬酸3. 丙酮酸4. 苹果酸5. 琥珀酸6. 乳酸7. 甲酸8. 乙酸9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸,啤酒的色谱图,1. 磷酸2. 柠檬酸3. 丙酮酸4. 苹果酸5. 琥珀酸6. 乳酸7. 甲酸8. 乙酸9. 焦谷氨酸 10. 碳酸前处理 振荡除去碳酸气后， 过滤10进样,清酒的色谱图,1. 磷酸2. 柠檬酸3. 丙酮酸4. 苹果酸5. 琥珀酸6. 乳酸7. 乙酸8.
3、焦谷氨酸前处理 过滤后，进样10,min.,葡萄酒的色谱图,1. 磷酸2. 柠檬酸3 . 酒石酸4. 苹果酸5. 琥珀酸6. 乳酸7. 甲酸8. 乙酸9. 焦谷氨酸 前处理 用水稀释10倍后过滤 进样量10,min.,酱油的色谱图,1. 磷酸2. 柠酸3. 丙酮酸4. 苹果酸5. 琥珀酸6. 乳酸7. 甲酸8. 乙酸9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸 前处理 用水稀释10倍后过滤 进样量10,血清的色谱图,1. 磷酸2. 柠檬酸3. 丙酮酸4. 乳酸5. 甲酸6. 乙酸7. 焦谷氨酸8. 未知物 前处理 加高氯酸用离心法去沉淀物，取上清液5uL进样,尿样的色谱图,1. 磷酸2. 柠檬酸3. 乳酸
4、4. 甲酸5. 未知物6. 焦谷氨酸7 未知物前处理 过滤后，进样10,酸奶的色谱图,1. 磷酸2. 柠檬酸3. 琥珀酸4. 乳酸5. 甲酸6. 乙酸前处理 用水稀释10倍后过滤 进样量10,工厂废水的色谱图,1. 甲酸2. 乙酸3. 丙酸4. 碳酸5. 丁酸6. 戊酸前处理 过滤后，进样10,食品安全是所有国家的每个消费者关心的基本问题。 残留农药和兽药是食品中主要的污染物 世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是在美国、加拿大、欧盟以及日本食品安全法规更加严格的完善。 在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的检测中非常苛刻的。,食品安全与污染物,农产品- 谷物：大米等- 豆类：大豆、豌
5、豆等。- 水果：橘柑，苹果，葡萄等。- 蔬菜：洋白菜（甘蓝）、菠菜等- 茶叶，种子，蜂蜜等。,食品中残留检测,审查农药残留,家畜及水产品- 牛肉，猪肉等- 鸡肉、鹌鹑等- 鱼类：黄尾鱼、虹鳟鱼，大马哈鱼等 - 虾，对虾,审查兽药残留,全世界使用的农药超过700种：杀虫剂，除草剂，杀菌剂，脱叶剂，植物生长调节剂。 残留：残存在农产品中的农药（降解缓慢）及其代谢物由以下原因所致：- 使用更稳定的化学物质作农药。- 农药的过度使用以及不合理使用。 最大残留限量(MRL)：食品安全的指标，通常MRL0.01-0.05mg/kg(ppm),食品中的农药残留,农药的残留（1）,有机氯化物：硫丹、荚蟥醚、克
6、菌丹、抑菌灵、乙酯杀螨醇、溴螨酯、六六六、滴滴涕、异狄氏剂、敌菌丹、狄氏剂、六氯苯、七氯 有机磷化物：苯硫磷，乙硫磷，灭线磷，乙嘧硫磷，硫线磷，喹硫磷，毒死蜱，甲基毒死蜱，毒虫畏，蔬果磷，敌敌畏，乐果，二嗪磷，甲基嘧啶磷，杀螟硫磷，丰索磷，倍硫磷，稻丰散，丙硫磷，仗杀硫磷，马拉硫磷，杀扑磷，异稻瘟净，敌瘟磷，甲基立枯磷，特丁硫磷，抑草磷，苯腈磷，对硫磷，甲基对硫磷，甲拌磷,氨基甲酸酯：灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁威，残杀威，恶虫威，速灭威，乙霉威，氯丙嗪，禾草丹 拟除虫菊酯氯氟氰菊酯，氟氯氰菊酯，氯氰菊酯，七氟菊酯，四溴菊酯，氰戊菊酯，氟氰戊菊酯，氟胺氰菊酯，氯菊酯 含氮化合物
7、： 甲氰菊酯，噻嗪酮，吡螨胺，恶霜灵，灭螨猛，三唑醇，三唑酮，氯苯嘧啶醇，氟酰胺，丙环唑，联苯三唑醇，灭锈胺，灭草灵，莠去津，双苯酸草胺，敌稗，二甲戊灵，氟乐灵，多效唑。,农药的残留（2）,在过去几年中，相关法规已完成或修订，控制程度更加严格。 在欧盟和美国已建立起完整的监测网络（参考实验室；参考材料及标准；计算机监视小组等） 在样品净化，色谱分离和检测中使用改进的和新的分析技术及方法，如GC/MS和LC/MS，就会产生更灵敏，更准确和更可靠的结果。 公众比以前更加关注食品安全。,欧盟和美国现在的形势,灭除威，异灭威，甲萘威，灭杀威，抗蚜威，仲丁威，残杀威，恶虫威，克百威 (呋喃丹),速灭威，
8、乙霉威，氯丙嗪，禾草丹,氨基甲酸酯类农药,氨基甲酸酯类农药结构,N-甲基氨基甲酸酯 的HPLC分析方法流程图,1、脱气装置 10、反应试剂输液机构 2、低压梯度装置 11、混合装置 3、流动相输液机构 12、荧光检测器 4、梯度混合器 13、阻尼盘管 5、自动进样器 14、反应盘管 6、柱温箱 15、反应盘管 7、分析柱 M1，M2：流动相 8、化学反应箱 R1，R2：反应试剂液 9、脱气装置,N-甲基氨基甲酸酯的HPLC 分析方法,N-氨基甲酸甲酯类农药的基本化学结构式它们的化合物在碱的条件下加水分解生成甲胺。这里生成的甲胺与一级胺的荧化衍生化试剂O-苯二甲醛（OPA）反应，可进行较高灵敏度
9、的荧光检测。,氨基甲酸酯前处理过程,8成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标准试样同时分析的色谱图,1994年6月9日官报上登载的成分的分析例,16成分的N-氨基甲酸甲酯类农药标准试样同时分析的色谱图,甲硫威及其代谢物,甲硫威代谢物高灵敏度分析例（例如在橘子汁中不得含50ppb以上）,甲硫威的检测限（S/N=3）为2ppb,离子色谱,离子色谱 过渡金属分析系统 CN- 离子分析系统,氨基酸分析系统,氨基酸分析系统,NH2R C COOHH,氨基酸衍生化方法,柱后衍生 柱前衍生,氨基酸,衍生化后的氨基酸,试剂,色谱柱,检测器,色谱柱,检测器,氨基酸,试剂,色谱柱,检测器,柱后衍生,色谱柱 : 阳离子交换
10、柱试剂 : 茚三酮方法 - UV/VIS 检测器OPA方法 - 荧光检测器,柱前衍生 异硫氰酸苯脂（PITC）,Column : Revered Phase Column (ODS) Reagent : OPA (Fluorescence)FMOC (Fluorescence)Fluorescamine (Fluorescence)DANS-Cl (Fluorescence)PITC (UV),柱前衍生步骤,1. 200uL样品中加入100mM异硫氰酸苯酯（乙腈溶液）100uL和1M三乙胺（乙腈溶液）100uL,室温下放置反应1小时 2. 反应液中加入400uL己烷 3. 放置，取下层溶液用一
11、次性滤膜过滤器（0 .45um ）过滤 4. 取滤液4uL注入,液相色谱常见问题及故障排除经验,液相系统维护流程图,色谱柱,等度系统,储液瓶,脱气机,泵单元,手动进样器,色谱柱,检测器,废液瓶,1 2 3 4 5 6 7,低压梯度系统,1 2 3 4 5 6 7 8 9,高压梯度系统,1 2 3 4 5 6 7 8,液相色谱故障排除经验,故障的确定至少要重复出现两次以上 初步判断故障引起的原因方法或硬件 由经验或平时的积累确定故障原因平时做好观察和记录 当不能确认故障原因时采用排除法逐一考察可能引起故障的因素 确定故障能否自行处理不要贸然拆卸不熟悉的部件,常见故障因素,仪器环境：实验室的温度、
12、湿度、酸度等实验室震动、灰尘等问题电源及地线问题 使用条件：流动相（pH值、均匀度、气泡等）样品（样品分解、氧化、样品溶剂等）色谱柱（污染、堵塞、塌陷等） 硬件问题：输液泵进样器检测器,平常保养,-做好平常的保养可以有效的降低故障的发生率 -做好平常的保养可以延长仪器的使用寿命常做的保养保证仪器的使用环境（经常清洁仪器，尤其是灰尘）泵的保养（使用缓冲盐时要清洗柱塞，水和盐不要长期保存在泵里）进样器要经常清洗，避免污染物吸附或堵塞管路尽量进行样品前处理色谱柱要定期清洗，保证柱效及使用寿命系统中不要长期保存水和盐，长时间不用时应将仪器所有部分全部更换为70以上的甲醇，避免细菌的滋生及盐的析出。,液
13、相色谱常见问题,压力异常（偏高、波动）漏液 保留时间漂移基线问题（漂移、噪声） 峰形异常,压 力,压力是液相色谱中最重要的指标，要经常关注压力的变化。保留时间的变化经常是由于压力问题引起的。不同溶剂即使在相同流速和温度的情况下压力也是不同的。记下仪器正常状态时，在固定条件下（流动相、流速、温度等）的压力显示值。,压力过高时,首先要确认是色谱柱堵塞还是系统堵塞色谱柱堵时，确认可能造成堵塞的样品的性质，相应选择合适的清洗溶剂。系统堵塞，首先应确认是哪一部份堵塞，依据情况由后向前进行排除。,容易发生堵塞的部件,保护柱及色谱柱线路过滤器混合器过滤组件管路连接处进样器检测器流通池,压力过低,如果压力为零
14、：泵头中没有液体，充满气泡单向阀完全堵死泵的柱塞杆折断压力传感器损坏(流动相流动正常，但无压力)如果有压力但是压力比正常时低：漏液 单向阀堵塞,压力波动,压力在短时间内剧烈波动。,泵头中有气泡单向阀脏柱塞密封圈漏液,经常漏液的部件,泵：柱塞密封圈,排液阀手动进样器：转子密封圈磨损 检测器： 流通池窗口（垫片损坏、透镜破碎） 接头处漏液：（接头松动，接头脏，接头磨损，部件不匹配）,保留时间不稳定,吸滤头脏 泵输液不正常（压力波动、气泡等） 流动相组分变化 流动相缓冲能力不够 色谱柱平衡时间不够 柱温的变化 柱子问题,噪音大,流动相污染、变质或由低品质溶剂配成 漏液 流动相、泵、检测器流通池内有气
15、泡 流动相各溶剂不相溶或混和不均匀 检测池能量不足 流通池被污染 温度影响（检测器和柱温差别太大） 其他电子设备的影响或电源、地线等,基线漂移,流动相污染，变质或由低品质溶剂配成 流动相不均匀(脱气，使用纯度更高的溶剂) 温度波动 系统平衡时间不够 流通池被污染或有气泡 流通池窗口破裂,峰形问题,死体积太大 柱子被污染或堵塞 色谱柱塌陷 流动相缓冲不足或不合适 样品溶剂选择不当，与流动相之间极性差异太大 样品过载（浓度或体积） 柱温过低,鬼峰,流动相被污染 进样阀残余峰 样品中未知物 色谱柱中的污染物,管线选择,材料不锈钢Teflon (聚四氟乙烯) PEEK (聚醚醚酮)尺寸0.1 mm I
16、.D. x 1.6 mmO.D. 0.3 mm I.D. x 1.6 mmO.D.0.5 mm I.D. x 1.6 mmO.D.0.8 mm I.D. x 1.6 mmO.D.,管线材料,不锈钢 (可用于所有连接) 能承受几千 kgf/cm2 压力 酸性或高浓度盐环境中易腐蚀 (尤其在pH小于2时)PEEK (可用于所有连接) 能承受高达 250 kgf/cm2压力 可在整个PH范围(pH 1-14)内使用 不适用于高溶解性溶剂如氯仿等Teflon (用于柱后阻尼管、反应管和排液管) 化学惰性大 能承受 5 kgf/cm2 压力,接头,不锈钢接头 / 垫圈主要用于输液泵、进样器的连接 能承受
17、 400 kgf/cm2压力 一旦固定，垫圈不可再动PEEK接头主要用于色谱柱、检测器的连接 易于安装 能承受 250 kgf/cm2压力 容易产生死体积,不锈钢接头,垫圈,PEEK接头,死体积,死体积可能会引起分离度变差和重现性变差等问题.,管线,公螺母,死体积,好的连接,差的连接,选择原则 采用 “HPLC” 级溶剂 避免使用会引起柱效损失或保留特性变化的溶剂 对试样有适宜的溶解度 溶剂粘度要小 与检测器相匹配,流动相,水 / 甲醇梯度ODS 柱,鬼峰,鬼峰的出现,流动相,水的等级 纯化水 蒸馏水 去离子水,波长 (nm),纯化水,去离子水,因为不纯物的存在，去离子的吸光率较高,纯化水中去
18、除了无机和有机的污染物,吸光率,流动相,流动相的更换,不互溶的流动相不能直接更换,缓冲盐不能直接用有机溶剂更换,水,正己烷,异丙醇,缓冲盐,有机溶剂,水,过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使用无机盐配制的缓冲液时。,溶剂前处理,吸滤头,吸滤头,材料：不锈钢(或陶瓷)烧结，孔径10um 故障：堵塞 表现：管路中不断有气泡生成 措施：用异丙醇（或5稀硝酸），超声波清洗，再用蒸馏水清洗,LC20AT主入口阀 部件号:228-45704-92,LC20AD入口阀 LC20AT副入口阀 部件号: 228-45704-91,LC20AD出口阀 部件号: 2
19、28-45705-91,单向阀,LC10ADvp出口阀 LC10ATvp出口阀 部件号: 228-34976-91,LC10ADvp入口阀 部件号: 228-39093-92,LC10ATvp入口阀 部件号: 228-32166-91,进样器,自动进样器 手动进样器(7725/7725i）原理：（六通阀）注入方式：1）全量注入2）部分注入,7725i手动进样阀,色谱柱的日常保养,购买新柱后一定要仔细阅读说明书，确认柱的使用条件以及清洗再生步骤，按照说明书条件测试色谱柱柱效，记录使用压力 定期检测柱压和柱效 不同流动相之间转换时应注意溶剂的互溶性 确认样品不会在流动相中析出或带有固体不溶物，请使
20、用0.45um或0.2um的一次性滤膜过滤样品，或者进行前处理。 为了延长色谱柱使用寿命，请使用保护柱。 定期用合适的溶剂清洗或再生色谱柱 长期不用时，清洗干净后，使用柱子说明书中指明的溶剂保存。柱子要从仪器上卸下并用堵头密封后保存。 定期用合适的流动相清洗保存的柱子，避免干涸。,峰产生有肩或分叉的原因,1. 柱子劣化（进口处产生不均匀的空隙）溶剂效应 3. 样品劣化（生成氧化物、分解物等）,判断标准所有的峰都产生有肩峰或分叉时则为柱子劣化,峰的变形,根部变宽,有肩或分叉,溶解样品的溶剂选择不当,最好不要选择高溶解性的试剂作为溶解样品的溶剂,最好注入少量样品,溶解性效应,低溶解性溶剂,高溶解性溶剂,检测器基线异常,基线噪音异常大 气泡未脱出 检测器污染 灯老化出现漂移或不规则波动 系统污染，如色谱柱、管路、检测器和流动相等等产生规则波动 室温变化，如空气调节器直吹检测器 泵的脉动,紫外灯的保养,氘灯保证寿命为2000小时 保证仪器的使用环境 在分析前、柱平衡得差不多时，再打开检测器紫外灯； 不要频繁的开关紫外灯，同样会损害紫外灯的寿命。一般间隔时间在三小时以上时,检测池背压,使用0.3 mm ID x 2 m 塑料管作为阻尼管连接于检测器出口，否则检测池中会有气泡产生连接阻尼管之前，必须先确认检测池能够承受的压力,
