1、DNA复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质、DNA复制过程 一、DNA 复制起始引发体的形成及所参与的酶和蛋白质DNA 复制起始一共涉及到 DnaA（复制起始因子，识别 OriC序列）、DnaB（DNA 解链酶）、DnaC（召唤 DnaB到复制叉）、HU（结合 DNA使之弯曲）、引物合成酶、单链 DNA结合蛋白、RNA 聚合酶、DNA 旋转酶、Dam甲基化酶，一共是 9种重要的酶或蛋白质，其中 DnaA、DnaB、引物合成酶、单链 DNA结合蛋白、Dam 甲基化酶非常重要。DNA 复制时，往往先由 RNA聚合酶在 DNA模板上合成一段 RNA引物，再由聚合酶从 RNA引物 3端开始合成新的
2、 DNA链。对于前导链来说，这一引发过程比较简单，只要有一段 RNA引物，DNA 聚合酶就能以此为起点，一直合成下去。对于后随链，引发过程较为复杂，需要多种蛋白质和酶参与。后随链的引发过程由引发体来完成。引发体由 6种蛋白质构成，预引体或引体前体把这 6种蛋白质结合在一起并和引发酶或引物过程酶进一步组装形成引发体。引发体似火车头一样在后随链分叉的方向前进，并在模板上断断续续的引发生成滞后链的引物 RNA短链，再由 DNA聚合酶 III 作用合成 DNA，直至遇到下一个引物或冈崎片段为止。由 RNA酶 H降解 RNA引物并由 DNA聚合酶 I 将缺口补齐，再由 DNA连接酶将每两个冈崎片段连在一
3、起形成大分子 DNA.。1.解链酶(helicase,unwinding enzyme)复制叉的形成则是由多种蛋白质及酶参与的较复杂的复制过程。在 DNA不连续复制过程中，结合于复制叉前面，在起始点处解开双链，反应是在解链酶的催化下进行的。解链酶有 ATP酶活性的酶，两种活性相互偶联，通过水解 ATP提供解链的能量。解链酶的作用就是打开DNA双链之间的氢键。解链酶分解 ATP的活性依赖于单链 DNA的存在。如果双链 DNA中有单链末端或切口，则 DNA解链酶可以首先结合在这一部分，然后逐步向双链方向移动。复制时，大部分 DNA解旋酶可沿滞后模板的 53方向并随着复制叉的前进而移动，只有个别解旋
4、酶（Rep 蛋白）是沿着 35方向移动的。故推测 Rep蛋白和特定 DNA解链酶是分别在 DNA的两条母链上协同作用以解开双链 DNA。大肠杆菌中 DnaB蛋白就有解链酶活性，与随从链的模板 DNA结合，沿 53方向移动，还有一种叫做 Rep蛋白和前导链的模板 DNA结合沿 35方向移动。2.单链结合蛋白(single strand binding proteins,SSBP)ssbDNA 蛋白是较牢固的结合在单链 DNA上的蛋白质。原核生物ssbDNA蛋白与 DNA结合时表现出协同效应：若第 1个 ssbDNA蛋白结合到 DNA上去能力为 1，第 2个的结合能力可高达 103；真核生物细胞中
5、的 ssbDNA蛋白与单链 DNA结合时则不表现上述效应。ssbDNA 蛋白的作用是保证解旋酶解开的单链在复制完成前能保持单链结构，它以四聚体的形式存在于复制叉处，待单链复制后才脱下来，重新循环。所以，ssbDNA蛋白只保持单链的存在，不起解旋作用。ssbDNA 蛋白稳定解开的单链，保证此局部不会恢复成双链。它与解开的单链 DNA结合，使其稳定不会再度螺旋化并且避免核酸内切酶对单链 DNA的水解，保证了单链 DNA做为模板时的伸展状态，SSBP 可以重复利用(图)。SSBP 与 DNA单链结合，既防止核酸水解酶的作用，又避免解开的单链 DNA重新缔合形成双链，从而保持一种伸展状态，以保证复制顺
6、利进行。在 E.coli中 SSB为四聚体，对单链 DNA有很高的亲和性，但对双链 DNA和 RNA没有亲和力。它们与 DNA结合时有协同作用。图 大肠杆菌 DNA复制叉中复制过程简图3、DNA 旋转酶(DNA gyrase )是一个由两个 GraA和两个 GraB亚基构成的四聚体蛋白，DNA 旋转酶以其可以利用 ATP结合和水解的能量来介导负超螺旋到松弛的共价闭合 DNA而闻名于所有拓扑异构酶。 它是DNA拓扑异构酶中的一种亚类，其主要功能为引入负超螺旋，在 DNA复制中起十分重要的作用。迄今为止，只有在原核生物中才发现 DNA旋转酶。 作用机理： DNA复制时解链产生正螺旋，阻碍复制体的前
7、进，DNA 旋转酶通过引起瞬间 DNA双链的断裂和重新连接，以改变DNA的拓扑状态，引入负超螺旋。4.引发体的形成：DNA 复制起始的关健步骤是前导链 DNA的合成，一旦前导链 DNA的聚合作用开始，随从链 DNA的合成也随着开始。由于前导链的合成是连续进行的，所以它的起始相对简单，而随从链的合成是不连续进行的，所以引发阶段比较复杂。大肠杆菌的引发前体由 Dna B. Dna C和单链结合蛋白组成。(1)引物酶(primase)它是一种特殊的 RNA聚合酶，可催化短片段 RNA的合成。这种短RNA片段一般十几个至数十个核苷酸不等，它们在 DNA复制起始处做为引物。RNA 引物的 3桹 H末端提
8、供了由 DNA聚合酶催化形成 DNA分子第一个磷酸二酯键的位置。催化 RNA引物合成的酶叫引发酶（primerase）。引发酶识别 DNA单链模板特异序列，以核糖核苷三磷酸为底物合成寡聚核苷酸，产生3-OH，为 DNA聚合酶起始磷酸二酯键提供条件。引物与典型的 RNA不同，他们在合成以后并不与模板分离，而是以氢键与模板结合。实验表明，在细菌中，前导链的引物和滞后链中前体片断的引物在合成时需要不同的条件。滞后链前体片断引物的合成是由引发酶催化的，而引发酶对利福平（rifampicin）不敏感，因此不受利福平抑制；前导链引物的合成是由 RNA聚合酶催化的，而 RNA聚合酶对利福平十分敏感，所以受利
9、福平强烈抑制。(2)引发体(primosome)高度解链的模板 DNA与多种蛋白质因子形成的引发前体促进引物酶结合上来，共同形成引发体，引发体主要在 DNA随从链上开始，它连续地与引物酶结合并解离，从而在不同部位引导引物酶催化合成 RNA引物，在引物 RNA的 3桹 H末端接下去合成 DNA片段，这就是随从链不连续合成的开始。5、DNA 聚合酶1）DNA 聚合酶 IDNA聚合酶 I最初由 Kornberg于 1955年在大肠杆菌中发现的，纯化的酶是一条相对分子量为 109KD的多肽链。用枯草杆菌蛋白酶处理可以将 DNA聚合酶 I水解为一大一小两个片段。较大的 C末端片断分子量为 68KD，叫
10、klenow片断，常用做体外合成DNA的工具酶；具有 53的聚合酶活性，可以将脱氧核苷三磷酸加到 DNA链的 3-OH 上，形成 3，5-磷酸二酯键，这个活性需要DNA模板和引物的存在。klenow 片断还具有 35的外切酶活性，可以从 3端将 DNA链水解。当正确的核苷三磷酸进入正在合成的链的末端，酶就向前移动，一旦发生错误，酶就退回，将错误的碱基切除，这是一种校对（proofreading）功能。较小的 N末端片断分子量为 35 KD，具有 53的外切酶活性，在体内功能是切除小的 DNA片断，包括切除 RNA引物。尽管 DNA聚合酶 I活性很高，但它们的主要功能是用于修复体内 DNA双螺旋
11、区中的单链区，这些单链区是在 DNA复制时或 DNA受损伤后留下的。DNA 聚合酶 I的 53核酸外切酶活性从 5端切除 DNA受损伤的部位，DNA 聚合酶 I的 53聚合酶活性随即开始工作，使 DNA链向 3端延伸，这称为切口平移（nick translation）。在 DNA复制中，RNA 引物的切除实际上就是切口平移；DNA 的损伤修复中也存在切口平移。在体外，可以用切口平移来制备高放射性活性的DNA探针。2）DNA 聚合酶DNA聚合酶全酶以异源复合体发挥功能。 亚基、 亚基和 亚基相连组成核心酶（core enzyme），每种亚基两个，形成两个催化合成DNA的活性中心。 亚基具有 53
12、的聚合酶活性，并具有53的外切酶活性； 亚基具有 35的外切酶活性，这对校正功能十分重要。核心酶在 亚基存在下，形成二聚体。其他亚基的添加促进二聚化和增强了酶活性（ 亚基起着促使核心酶二聚化的作用）。DNA聚合酶具有持续合成能力， 亚基在二聚体形成中发挥重要的作用。 亚基的功能犹如夹子、两个 亚基夹住 DNA分子并可以向前滑动，使聚合酶在完成复制前不再脱离 DNA，从而提高了酶的持续合成能力（通过它形成一个环使 DNA聚合酶的核心酶附着在 DNA模板上，并可以沿单链 DNA滑动而使 DNA的复制过程程序化）。 亚基的定位能防止核心酶在 DNA复制过程中从模板上掉下来，如果没有 亚基，核心酶只能
13、合成大约 20个核苷酸就要脱离模板。除了 亚基以外， 亚基是一种依赖于 DNA的 ATP酶，两个 亚基与另 4个亚基（ 亚基、亚基、 亚基、 亚基）构成 复合物，其主要功能时帮助 亚基夹住 DNA，故称夹子装置器（clamp loader）。 亚基在 DNA上定位和解离都需要 复合物介导。完整全酶为不对称二聚体结构。当聚合酶遇到逆向模板上前面合成的冈崎片断时， 复合物的存在允许 亚基从模板上解离。这样当核心酶合成了冈崎片断，将从后滞链的全酶中释放出来，与下一个由 DNA引发酶提供的模板引物的起始前复合物结合。在半不连续复制过程重，同一个 DNA聚合酶分子可以同时合成前导链和滞后链。更确切地讲，
14、在前导链和滞后链的生长点，核苷酸的增加同时进行。如前所述，DNA 聚合酶有两个 DNA合成催化中心，很可能前导链和滞后链各利用一个催化中心合成 DNA。滞后链的模板链围绕一个催化中心折叠成环状结构，使滞后链的方向颠倒(生化方向不变)。6、DNA 连接酶DNA连接酶催化双股链内相邻单链切口的 3-OH 与 5- P酰基形成磷酸酯键。酶的活化? NAD+或 ATP中的腺苷酰基（AMP）与酶活性中心的赖氨酸残基的 -NH2 以磷酰胺键结合，形成共价中间体酶- AMP；腺苷酰化 DNA? 酶- AMP将腺苷酰基（AMP）转移给 DNA切口处的 5磷酰基团，以焦磷酸的形式活化，形成 AMP-P-DNA。
15、亲核攻击完成 DNA连接? 通过相邻 DNA的 3-OH 对活化的 P原子进行亲核攻击，生成 3，5-磷酸二酯键，同时释放出 AMP。二、DNA 复制过程真核、原核的复制大致可以分为复制的引发，DNA 链的延伸和 DNA复制的终止三个阶段。起始：DNA 解旋酶在局部展开双螺旋结构的 DNA分子为单链，引物酶辨认起始位点，以解开的一段 DNA为模板，按照 5到 3方向合成 RNA短链。形成 RNA引物。DNA片段的生成：在引物提供了 3-OH末端的基础上，DNA 聚合酶催化DNA的两条链同时进行复制过程，由于复制过程只能由 5-3方向合成，因此一条链能够连续合成，另一条链分段合成，其中每一段短链
16、成为冈崎片段（Okazaki fragments）(由日本冈崎夫妇发现并命名)。RNA引物的水解：当 DNA合成一定长度后，DNA 聚合酶水解 RNA引物，补填缺口。DNA连接酶将 DNA片段连接起来，形成完整的 DNA分子。最后 DNA新合成的片段在旋转酶的帮助下重新形成螺旋状。(一)DNA 复制的引发复制的引发(Priming)阶段包括 DNA复制起点双链解开，通过转录激活步骤合成 RNA分子，RNA 引物的合成，DNA 聚合酶将第一个脱氧核苷酸加到引物 RNA的 3-OH末端。复制引发的关键步骤就是前导链 DNA的合成，一旦前导链 DNA的聚合作用开始，滞后链上的 DNA合成也随着开始，
17、在所有前导链开始聚合之前有一必需的步骤就是由 RNA聚合酶(不是引物酶)沿滞后链模板转录一短的 RNA分子。在有些 DNA复制中，(如质粒 ColE)，该 RNA分子经过加式成为 DNA复制的引物。但是，在大部分 DNA复制中，该RNA分子没有引物作用。它的作用似乎只是分开两条 DNA链，暴露出某些特定序列以便引发体与之结合，在前导链模板 DNA上开始合成 RNA引物，这个过程称为转录激活(transcriptional activation)，在前导链的复制引发过程中还需要其他一些蛋白质，如大肠杆菌的 dnaA蛋白。这两种蛋白质可以和复制起点处 DNA上高度保守的 4个 9bp长的序列结合，
18、其具体功能尚不清楚。可能是这些蛋白质与 DNA复制起点结合后能促进 DNA聚合酶复合体的七种蛋白质在复制起点处装配成有功能的全酶。DNA 复制开始时，DNA 螺旋酶首先在复制起点处将双链DNA解开，通过转录激活合成的 RNA分子也起分离两条 DNA链的作用，然后单链 DNA结合蛋白质结合在被解开的链上。由复制因子 X(n蛋白)，复制因子 Y(n蛋白)，n“蛋白，i 蛋白，dnaB 蛋白和 dnaC蛋白等 6种蛋白质组成的引发前体(preprimosome)，在单链 DNA结合蛋白的作用下与单链 DNA结合生成中间物，这是一种前引发过程。引发前体进一步与引物酶(primase)组装成引发体(pr
19、imosome)。引发体可以在单链DNA上移动，在 dnaB亚基的作用下识别 DNA复制起点位置。首先在前导链上由引物酶催化合成一段 RNA引物，然后，引发体在滞后链上沿53方向不停的移动(这是一种相对移动，也可能是滞后链模板在移动，见后)，在一定距离上反复合成 RNA引物供 DNA聚合酶合成冈崎片段使用，引发体中许多蛋白因子的功能尚不清楚。但是，这些成份必须协同工作才能使引发体在滞后链上移动，识别合适的引物合成位置，并将核苷酸在引发位置上聚合成 RNA引物。由于引发体在滞后链模板上的移动方向与其合成引物的方向相反，所以在滞后链上所合成的 RNA引物非常短，一般只有 3-5个核苷酸长。而且，在
20、同一种生物体细胞中这些引物都具有相似的序列，表明引物酶要在 DNA滞后链模板上比较特定的位置(序列)上才能合成 RNA引物。为什么需要有 RNA引物来引发 DNA复制呢?这可能尽量减少 DNA复制起始处的突变有关。DNA 复制开始处的几个核苷酸最容易出现差错，因此，用 RNA引物即使出现差错最后也要被 DNA聚合酶切除，提高了 DNA复制的准确性。RNA 引物形成后，由 DNA聚合酶催化将第一个脱氧核苷酸按碱基互补原则加在 RNA引物 3-OH端而进入 DNA链的延伸阶段。(二)DNA 链的延伸以复制叉向前移动的方向为标准，一条模板链为 35走向，在其上 DNA能以 53方向连续合成，称为前导
21、链(leading strand)；另一条模板链为 53走向，在其上 DNA也是 53方向合成，但与复制叉移动的方向正好相反，故随着复制叉的移动形成许多不连续的冈崎片段，最后在连成一条完整的 DNA链，该链称为后随链(lagging strand)。两条单链 DNA复制的引发过程有所差异，但是不论是前导链还是后随链，都需要一段 RNA引物用于开始子链 DNA的合成。因此前导链与后随链的差别在于前者从复制起始点开始按 53持续的合成下去，不形成冈崎片段，后者则随着复制叉的出现，不断合成长约 23kb的冈崎片段。 DNA 新生链的合成由 DNA聚合酶所催化，然而，DNA 必须由螺旋酶在复制叉处边移
22、动边解开双链。这样就产生了一种拓扑学上的问题:由于 DNA的解链，在 DNA双链区势必产生正超螺旋，在环状 DNA中更为明显，当达到一定程度后就会造成复制叉难再继续前进，从而终止DNA复制。但是，在细胞内 DNA复制不会因出现拓扑学问题而停止。有两种机制可以防止这种现象发生:1DNA 在生物细胞中本身就是超螺旋，当 DNA解链而产生正超螺旋时，可以被原来存在的负超螺旋所中和;2DNA拓扑异构酶要以打开一条链，使正超螺旋状态转变成松弛状态，而 DNA拓扑异构酶(旋转酶)可以在 DNA解链前方不停地继续将负超螺旋引入双链 DNA。这两种机制保证了无论是环状 DNA还是开环 DNA的复制顺利的解链，
23、再由 DNA聚合酶合成新的 DNA链。前已述及 DNA生长链的延伸主要由 DNA聚合酶催化，该酶是由 7种蛋白质(多肽)组成的聚合体，称为全酶。全酶中所有亚基对完成 DNA复制都是必需的。 亚基具有聚合功能和 53外切酶活性， 亚基具有 35外切酶活性。另外，全酶中还有 ATP分子它是 DNA聚合酶催化第一个脱氧核糖核苷酸连接在 RNA引物上所必需的，其他亚基的功能尚不清楚。在 DNA复制叉处要能由两套 DNA聚合酶在同一时间分别进行复制 DNA前导链和滞后链。如果滞后链模板环绕 DNA聚合酶全酶，并通过 DNA聚合酶，然后再折向与未解链的双链 DNA在同一方向上，则滞后链的合成可以和前导链的
24、合成在同一方向上进行。这样，当 DNA聚合酶沿着滞后链模板移动时，由特异的引物酶催化合成的 RNA引物即可以由 DNA聚合酶所延伸。当合成的 DNA链到达前一次合成的冈崎片段的位置时，滞后链模板及刚合成的冈崎片断便从 DNA聚合酶上释放出来。这时，由于复制叉继续向前运动，便产生了又一段单链的滞后链模板，它重新环绕 DNA聚合酶全酶，并通过 DNA聚合酶开始合成新的滞后链冈崎片段。通过这样的机制，前导链的合成不会超过滞后链太多(最后只有一个冈崎片段的长度)。而且，这样引发体在 DNA链上和 DNA聚合酶以同一速度移动。按上述 DNA复制的机制，在复制叉附近，形成了以两套 DNA聚合酶全酶分子、引
25、发体和螺旋构成的类似核糖体大小的复合体，称为DNA复制体(replisome)。复制体在 DNA前导链模板和滞后链模板上移动时便合成了连续的 DNA前导链和由许多冈崎片段组成的滞后链。在DNA合成延伸过程中主要是 DNA聚合酶的作用。当冈崎片段形成后，DNA聚合酶通过其 53外切酶活性切除冈崎片段上的 RNA引物，同时，利用后一个冈崎片段作为引物由 53合成 DNA。最后两个冈崎片段由 DNA连接酶将其接起来，形成完整的 DNA滞后链。实验证明 DNA的复制是由一个固定的起始点开始的。一般把生物体的单个复制单位称为复制子。一个复制子只含一个复制起点。一般说，细菌，病毒即线粒体 DNA分子均作为
26、单个复制子完成其复制，真核生物基因组可以同时在多个复制起点上进行双向复制，即它们的基因组包括多个复制子。多方面的实验结果表明，大多数生物内 DNA的复制都是从固定的起始点以双向等速方式进行的。复制叉以 DNA分子上某一特定顺序为起始点，向两个方向等速生长前进。(三)DNA 复制的终止过去认为，DNA 一旦复制开始，就会将该 DNA分子全部复制完毕，才终止其 DNA复制。但最近的实验表明，在 DNA上也存在着复制终止位点，DNA 复制将在复制终止位点处终止，并不一定等全部 DNA合成完毕。但目前对复制终止位点的结构和功能了解甚少在 NDA复制终止阶段令人困惑的一个问题是，线性 DNA分子两端是如
27、何完成其复制的?已知 DNA复制都要有 RNA引物参与。当 RNA引物被切除后，中间所遗留的间隙由 DNA聚合所填充。但是，在线性分子的两端以 53为模板的滞后链的合成，其末端的 RNA引物被切除后是无法被 DNA聚合酶所填充的。在研究 T7DNA复制时，这个问题部分地得到了解决。T7DNA 两端的DNA序列区有 160bp长的序列完全相同。而且，在 T7DNA复制时，产生的子代 DNA分子不是一个单位 T7DNA长度，而是许多单位长度的 T7DNA首尾连接在一起。T7DNA 两个子代 DNA分子都会有一个 3端单链尾巴，两个子代 DNA的 3端尾巴以互补结合形成两个单位 T7DNA的线性连接
28、。然后由 DNA聚合酶填充和 DNA连接酶连接后，继续复制便形成四个单位长度的 T7DNA分子。这样复制下去，便可形成多个单位长度的T7DNA分子。这样的 T7DNA分子可以被特异的内切酶切开，用 DNA聚合酶填充与亲代 DNA完全一样的双链 T7DNA分子。在研究痘病毒复制时，发现了线性 DNA分子完成末端复制的第二种方式。痘病毒 DNA在两端都形成发夹环状结构。DNA 复制时，在线性分子中间的一个复制起点开始，双向进行，将发夹环状结构变成双链环状 DNA。然后，在发夹的中央将不同 DNA链切开，使 DNA分子变性，双链分开。这样，在每个分子两端形成一个单链尾端要以自我互补，形成完整的发夹结
29、构，与亲代 DNA分子一样。在真核生物染色体线性DNA分子复制时，尚不清楚末端的复制过程是怎样进行的。也可能像痘病毒那样形成发夹结构而进行复制。但最近的实验表明，真核生物染色体末端 DNA复制是由一种特殊的酶将一个新的末端 DNA序列加在刚刚完成复制的 DNA末端。这种机制首先在四膜虫中发现。该生物细胞的线性 DNA分子末端有 30-70拷贝的 5TTGGGG3序列，该细胞中存在一种酶可以将 TTGGGG序列加在事先已存在的单键 DNA末端的 TTGGGG序列上。这样有较长的末端单链 DNA，可以被引物酶重新引发或其他的酶蛋白引发而合成 RNA引物，并由 DNA聚合酶将其变成双链 DNA。这样就可以避免其 DNA随着复制的不断进行而逐渐变短。在环状 DNA的复制的末端终止阶段则不存在上述问题。环状 DNA复制到最后，由 DNA拓扑异构酶切开双链 DNA，将两个 DNA分子分开成为两个完整的与亲代 DNA分子一样
