1、1,血小板的 止血作用及检测,王 学 锋,上海交通大学医学院 附属瑞金医院,2,3,直径2-4um, 厚0.2-0.4um,4,星形，圆形，椭圆形，不规则形,5,图19 人血涂片示聚集的血小板和嗜酸性粒细胞,6,7,Scanning election micrograph of normal human blood cells (E红细胞 G粒细胞 L淋巴细胞 M单核细胞 P血小板),8,血液涂片中的血小板,9,The Normal In - Situ Process,FIG 1: Normal blood vessel,Intima/media withendothelial cellbas
2、al membranesmooth muscle cellscollagen fibers,erythrocytethrombocytelumenleukocyte,Hemostasis,10,FIG 2 Injured blood vessel Exposure of collagen Adhesion of platelets mediated by vWF Activation and de-granulation of platelets Aggregation of platelets,erythrocyte non-activated thrombocyte lumen endot
3、helial cell basal membrane activated collagen- bound thrombocyte collagen fibers smooth muscle cells,Hemostasis,The Normal In - Situ Process,11,FIG 3 Platelet plug stabilization by fibrin,lumen endothelial cell basal membrane erythrocytes activated thrombocytes plug sealing and stabilization by fibr
4、in formation,The Normal In - Situ Process,Hemostasis,12,一、血小板的结构,13,图22 血小板电镜像 (1横切面 2纵切面 3膜 4糖衣 5线粒体 6血小板颗粒 7小管系 8糖原颗粒),14,15,16,电镜下血小板超微结构：表面结构，骨架系统，细胞器，特殊膜系统,静止相 机能相,17,表 面 结 构,18,表面结构,细胞外衣 糖蛋白的糖链（血小板膜受 体的所在位置） 细胞膜 蛋白质与脂质 开放管道系统的开口,19,Fibronectin,Thrombin,TSP,vWF,Collagen,Fibrinogen vWF，Fibronect
5、in,GPIc/IIa,GPV,GPIV,GPIa/IIa,GPIb/IX,GPIIb/IIIa,1.糖蛋白：受体特性,图3. 血小板的表面结构模式图2,ICSH,CD42b/42a,CD41/61,CD36,CD49b/29,21,d-granule,a -granule,GPIb-IX receptor-complex,von Willebrand - Factor,fibrinogen,GPIIb-IIIa receptor-complex,Release ofglycoproteinsvWFfibrinogencoagulation factors,Release ofADPserot
6、onincalciumetc,platelet,Primary Hemostasis,Normal Platelet Function,22,d-granule,a-granule,Glanzmann Thrombastenia,Bernard-Soulier Syndrome,platelet,No release from granules: Gray syndrome (no a-granules) Storage Pool Disease (no d-granules) Secretion defects (granules are present but secretion is i
7、nhibited),Primary Hemostasis,Congenital Platelet Dysfunctions,23,Von Willebrand Disease Mechanism,Primary Hemostasis,d-granule,a-granule,GPIb/Ix receptor-complex,von Willebrand - Jrgens Syndrome,platelet,24,重要糖蛋白缺乏所导致的疾病?,25,生化组成,磷脂酰胆碱（PC）磷脂酰乙醇胺（PE）膜磷脂 鞘磷脂甘油磷脂 磷脂酰丝氨酸（PS）磷脂酰肌醇（PI）溶血卵磷脂 胆固醇糖脂,膜脂质,75%8
8、0%,20%25%,2%5%,2.膜脂质,SPH,platelet factor 3,2.膜脂质,图4. 血小板的表面结构模式图3,（二）血小板骨架系统和收缩蛋白,. 微管 Microtubule . 微丝 Microfilaments . 膜下细丝 Submembrane filaments,图5. 血小板的骨架系统模式图4,28,A and B,二聚体,细丝,微管,微管 维持血小板形态,29,骨架系统和收缩蛋白,微丝 肌动蛋白细丝及肌球蛋白粗丝,参与血小板收缩活动，伪足形成和释放 膜下细丝,（三）血小板细胞器和内容物,1.-颗粒（ granule）：P-selectin，PF4，-TG，T
9、SP，Fn,2.致密颗粒（dense body， 颗粒）：ADP，ATP,3. 溶酶体颗粒（颗粒）：组织蛋白酶D、E、O等,图6. 血小板细胞器模式图5,31,细胞器和内容物,血小板活化？,（四）血小板特殊膜系统,图7. 血小板细胞器模式图6,开放管道系统： (open canalicular system,OCS)交换通道,致密管道系统： (dense canalicular system,DTS),Ca2+,33,FIG 4a Cellular organiza-tion of a platelet, side cross-view,outer membrane surface conne
10、cted canalicular system actin microtubuli dense (d-) granules alpha (a-) granules lysosomes mitochondria,FIG 4b Equatorial cross-view,Primary Hemostasis,The Platelet,总结：,二、血小板的活化 及其分子基础,36,1.血小板形态的改变 2.血小板表面特殊蛋白的表达(GPIIb/IIIa,CD62P) 3.血浆血小板特异产物水平增 (PF4，-TG，TXA2),(一) 血小板活化的表现,37,1.血小板收缩的基础:在活性物质的作用下发
11、生骨架蛋白的收缩,(二) 血小板活化的分子基础,Resting Platelet,Activated Platelet,活化激活剂: throbin、collagen、 TXA2、PAF、 adrenaline、ADP、 Vasopridsin、等,图9. 血小板活化示意图,38,2.血小板表面物质表达基础:,(二) 血小板活化的分子基础,GPb/a,P-selectin,图10. 血小板表面物质表达,39,3.血小板代谢基础 （1）能量代谢,(二) 血小板活化的分子基础,葡萄糖 glucose,糖酵解,丙酮酸,乳酸,三羧酸循环,CO2,图11. 血小板能量代谢,（2）膜磷脂代谢,Ca2+,P
12、C PE PI,溶血PC、PE、PI,PIP2,DAG,AA,环 氧 化 酶,PGG2,PGH2,5-HPETE,LTA2,PGI2,TXA2,脂 肪 加 氧 酶,Platelet factor 3,前列环素 合成酶,血栓素 合成酶,secretion,PLC,PLC,PLA2,图12. 血小板膜磷脂代谢,血管内皮细胞,41,42,花生四烯酸代谢产物,TXA2 收缩血管 促进血小板聚集,PGI2 舒张血管 抑制血小板聚集,43,三、血小板功能,45,1.定义：是指Plt粘附于血管内皮下组分或其他物质表面的能力,(一) 粘附功能（ Platelet adhesion ）,一. 粘 附 功 能,v
13、WF,胶原 ,Adhesion,GPa-a,GPb-,Resting Platelet,图13. 血小板粘附模式图,黏附反应需要条件?,47,1.定义：是指Plt与Plt之间的粘附，是形成血小板血栓的基础，也是血小板进一步活化和参与二期止血、促进血液凝固的保证。,(二) 聚集功能（ Platelet aggregation ）,48,Resting Platelet,ADP,GP,Activated Platelet one,GPb-a,Aggregation,二. 聚 集 功 能,a,GPb-a,Fibrinogen,Ca+,图14. 血小板聚集模式图,49,Dense Granule,Pl
14、atelet Aggregation,50,血小板聚集功能,定义 三个要素 GPIIb/IIIa ,Fg,Ca2+ 诱导剂的作用 高切变率的条件下,vWF与Fn也参与血小板聚集 图7 （幻灯）,51,52,2.诱聚剂：低分子物质：ADP、肾上腺素、TXA2、5-HT等。蛋白水解酶：a、蛇毒等颗粒及巨分子：胶原、微纤维等凝集素：瑞斯托霉素等,53,血小板聚集,三种途径 ADP TXA2 PGG2, PGH2 ,TXA2 PAF,54,血小板聚集,两种聚集波形,55,1.定义： 指血小板被机械或诱导剂激活后,Plt、及溶酶体等贮存颗粒中的内容物通过OCS释放到Plt外的过程,(三) 释放反应（ P
15、latelet release reaction ）,56,RestingPlatelet,ADP,Activated Platelet one,a,三. 释放反应,颗粒： -TGPF4TSP 致密颗粒：ADP,P-selectin,Ca2+,图15. 血小板释放模式图,release,57,58,四. 促 凝 作 用,a,Ca,a,a,Fg,a,a,Ca,FIBRIN CLOT,PF3,PF3,a- -Ca2+,PF3,Coagulation,a-a Ca2+,PF3,凝血活酶,图16. 血小板促凝作用模式图,60,Trombogenese,Simons ML, Decker JW. Br
16、Heart J 1995;74:337; Katzung BG. Basic & Clinical Pharmacology, Appleton & Lange, 2001,61,血小板的促凝活性,PF3的促凝活性 （参与两个复合物形成） 接触产物生成活性（CPFA）：胶原、ADP 胶原诱导的凝血活性（CICA）：胶原 颗粒中的凝血因子释放（FV、Fg、FXI） 凝血酶原酶合成：FXa结合位点,62,五. 血 块 收 缩 功 能,图17. 血小板血块收缩功能模式图,63,六、 维护血管内皮细胞完整性,填充空隙 参与内皮细胞再生和修复,总结：血小板功能,1.粘附功能,2.聚集功能,3.释放反应,
17、4.促凝作用,5.血块收缩作用,6.维护血管内皮细胞完整性,65,66,血 小 板 检 验,67,血小板生存时间测定 （丙二醛法,MDA法）,68,血小板寿命测定还可以有其他方法?,69,Arachidonic acid,Cyclo-oxygenase,Endoperoxidases ,MDA ,Effects of Aspirin,Inhibition,Cyclo-oxygenase,Endoperoxidases ,MDA ,70,血小板生存时间测定,缩短 血小板破坏、消耗增多 ITP、药物免疫性血小板减少性紫癜、输血后紫癜、脾功能亢进、SLE、DIC、TTP、HUS 血栓性疾病 心肌梗死
18、、DVT、糖尿病血管病变,71,血小板自身抗体测定,72,血小板自身抗体,血小板相关免疫球蛋白(PAIg G,A,M) 血小板蛋白自身抗体(特异性) 药物相关自身抗体 同种血小板自身抗体,73,血小板相关免疫球蛋白检测,74,PLATELET IMMUNOFLUORESCENCE,patient,donor,eluaat,75,单克隆抗体血小板抗原固定试验 (monoclonal antibody immobilazation of platelet antigen,MAIPA),76,MoAb incubation + solubilisation,GM ELISA plates + lab
19、eled anti Human IgG,substrate reaction,Sanquin,77,改良抗原捕获酶联免疫吸附试验 (modified antigen capture ELISA,MACE),78,MACE,健康人血小板+待测血清,孵育后裂解,加入包被不同鼠抗血小板膜糖蛋白抗体微孔中,79,临床意义 增高 见于ITP、同种免疫性血小板减少性紫癜、药物免疫性血小板减少性紫癜、恶性淋巴瘤、Evan综合征、SLE、慢性活动性肝炎等 动态检测有利于疗效和预后判断,80,血小板黏附试验（玻株柱法）,81,82,血小板黏附试验（玻株柱法）,血小板黏附率（%）=柱前血小板数柱后血小板数 100
20、%柱前血小板数问题:柱前血小板数250109/L,柱后血小板数125 109/L,黏附率?,83,血小板黏附试验,临床意义 增高 高凝状态与血栓性疾病 降低 vWD 、巨血小板综合征、血小板无力症、尿毒症、肝硬化、MDS、服用血小板抑制药物,84,血小板聚集试验,85,透射比浊法测定原理,诱导剂,86,透射比浊法测定原理,87,88,89,90,91,92,93,散射比浊法测定原理,诱导剂,94,散射光测定,95,阻抗法,96,阻抗法的优点,直接使用全血 其他血细胞同时存在，真正模拟体内生理环境 保存全部血小板，避免大血小板在制备PRP时丢失 对于脂血标本的检测，可以克服光学法检测时因过于浑浊
21、而影响结果 全血电阻聚集仪与光学法相比，检测高凝状态时的血小板功能更为敏感,97,血小板聚集试验,临床意义 增高 反映血小板聚集功能增强。见于血栓前状态和血栓性疾病。 降低 反映血小板聚集功能减弱。见于血小板无力症、巨血小板综合征、储存池病、尿毒症、肝硬化、MDS等,98,血小板第3因子有效性测定,99,原理,a,Ca,a,a,Fg,a,a,Ca,FIBRIN CLOT,PF3,PF3,a- -Ca2+,PF3,Coagulation,a-a Ca2+,PF3,凝血活酶,100,血小板第3因子有效性测定,组别 患者血浆（ml） 正常血浆（ml）PRP PPP PRP PPP 一 0.1 0.1
22、 二 0.1 0.1 三 0.1 0.1 四 0.1 0.1,参考值 APTT 1-APTT 25s,101,血小板第3因子有效性测定,临床意义降低 见于先天性血小板第3因子缺乏症、血小板无力症、巨血小板综合征、肝硬化、MDS、尿毒症、DIC、AL、再生障碍性贫血以及某些药物的影响等,102,血块收缩试验,103,血块收缩试验,104,血小板膜糖蛋白检测,105,流式细胞仪原理示意图,106,无需分离，快速检测，避免血小板的激活 针对单个细胞分析 最少的标本处理，避免血小板亚群的丢失 测定血小板的活化状态，检查循环血小板反应性,FCM,107,FCM,可以测定膜表面多种受体的变化 新单抗，新功
23、能性抗原决定簇检测 极高灵敏度，检出仅有1%活化血小板亚群 需微量体积标本（约2l），适合于新生儿 血小板明显减少标本，也能进行准确的分析 无放射性核素污染,108,糖蛋白阳性血小板百分率,GPIb(CD42b) GPIIb(CD41) GPIIIa(CD61) GPIX(CD42a) CD62P(P-Selectin) 2% CD63 2% FIBR 5%,95%99%,109,110,111,112,流式细胞仪检测血小板活化,R2细胞群为单个血小板，R3细胞群为聚集的血小板 图1a为未加ADP的血小板分布；图1b示ADP活化后的血小板荧光强度、FSC均抬高，R2细胞群明显减少，R3明显增加
24、，直观的表明血小板发生了聚集。并可自动计算出图T3门中血小板占总血小板的百分率，即为血小板聚集率。,113,临床意义,血小板功能缺陷病 血栓前状态和血栓病:CD41,CD61,CD62P,CD63,114,FCM与聚集仪测定血小板聚集的敏感性比较,115,血小板活化分析,116,血小板膜磷脂酰丝氨酸和凝血因子,荧光素标记的Annexin V(PS特异结合),Fib FV/Va FX/Xa 的单抗+PLT,FCM检测荧光强度,117,活化血小板膜糖蛋白分子标志物,CD41,CD61,CD62P,CD63,118,血小板微粒,活化出芽 0.1-1.0um 相同结构,119,血浆血栓烷B2（TXB2
25、）测定,原理 ELISA 临床意义 增高 血栓前状态与血栓性疾病 降低 见于环氧化酶或TX合成酶缺乏症、服用抑制环氧化酶或TX合成酶的药物等。,120,11-去氢血栓烷B2（TXB2）测定,原理 ELISA TXB2在肝脏氧化酶作用下的产物 不受体外血小板活化的影响,121,血浆 -TG、PF4测定,原理 双抗体夹心法 临床意义 增高 反映血小板被激活及其释放反应亢进。 降低 见于先天或获得性储存池病。,122,血小板功能分析仪PFA-100,123,PFA-100 血小板功能测定仪,溶液贮藏器,按钮,屏幕,打印机,圆盘传送带,暗盒,测试暗盒,124,In Vivo Haemostasis,P
26、FA-100,capillary 200m,aperture 150m,epinephrine or ADP,platelet,vWF,erythrocyte,FLOW,- 40 mbar,collagen,membrane,PFA-100 Test Principle,lumen,fibrinogen,platelet,collagen fibrils,erythrocyte,endothelial cell,vWF,125,Test Cartridge before and after a test,before,after,aperture 150 M ,cup,platelet,agg
27、regate,Filter + epinephrine or ADP,flash membrane,800 l blood,capillary 200 M,collagen,PFA-100 Test Principle,126,PFA-100 Test Principle,Occlusion Process,127,PFA-100 REV. 2.00 S/N: 0037014/07/97 14:01ID#: 23456.17 Test Type: Collagen/EPI SAMPLE A: 110 SEC,Final Result and Print-out,Closure time in seconds indi- cating “Primary-Hemostasis- Capacity (PHC)”,PFA-100 Test Principle,128,Method Simplicity,PFA-100 Test Advantages and Benefit,129,衷心感谢各位,
