1、1DNA 提取和 PCR课题 1 DNA 的粗提取与鉴定一、基础知识(一)提取 DNA 的方法提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于 DNA 的粗提取而言,就是要利用 DNA 与 RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异,提取 DNA,去除其他成分。(1)DNA 的溶解性: DNA 和蛋白质等其他成分在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度不同,利用这一特点,选择适当的盐浓度就能使 DNA 充分溶解,而使杂质沉淀,或者相反,以达到分离目的。 此外,DNA 不溶于酒精溶液,但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理,可以将 DNA
2、与蛋白质进一步的分离。(2)DNA 对酶、高温和洗涤剂的耐受性:蛋白酶能水解蛋白质,但是对 DNA 没有影响。大多数蛋白质不能忍受 6080oC 的高温,而 DNA 在 80以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜,但对 DNA 没有影响。(二)DNA 的鉴定在沸水裕条件下,DNA 遇二苯胺会被染成蓝色,因此二苯胺可以作为鉴定 DNA 的试剂。二、实验设计(一)实验材料的选取 凡是含有 DNA 的生物材料都可以考虑,但是使用 DNA 含量相对较高的生物组织,成功的可能性更大。(二)破碎细胞,获取含 DNA 的滤液 动物细胞的破碎比较容易,以鸡血细胞为例,在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水,同时用玻璃棒
3、搅拌,过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细胞,需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如,提取洋葱的 DNA 时,在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐,进行充分的搅拌和研磨,过滤后收集研磨液。注意:不能用哺乳动物的成熟红细胞提取 DNA。(三)去除滤液中的杂质 方案一 利用 DNA 在不同浓度的 NaCl 溶液中溶解度的不同,通过控制 NaCl 溶液的浓度去除杂质。方案二 直接在滤液中加入嫩肉粉,反应 1015min,嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。方案三 将滤液放在 6075的恒温水浴箱保温 1015min,注意严格控制温度范围。(四)DNA 的析出与鉴定 1、将处理后的溶液过滤,加入与滤液体积
4、相等的、冷却的酒精溶液(体积分数为 95%) ,静置 23min,溶液中会出现白色丝状物,这就是粗提取的 DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌,卷起丝状物,并用滤纸吸取上面的水分。2、取两支 20ml 的试管,各加入物质的量浓度为 2mol/L 的 NaCl 溶液 5ml,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入 4ml 的二苯胺试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热 5min,待试管冷却后,比较两支试管溶液颜色的变化,看看溶解有 DNA 的溶液是否变蓝。实例:用鸡血细胞液粗提取 DNA 并鉴定步骤 操作 图示1、提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液(
5、已在课前配好)510mL,注入到 50ml 烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水 20mL,同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌 5min,然后,用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至 1000mL 的烧杯中,取其滤液,滤液中含有核 DNA 和其它杂质。22、溶解细胞核内的DNA将物质的量浓度为 2molL 的 NaCl 溶液 40 mL 加入到滤液中,并作玻璃棒沿一个方向搅拌 1min,使其混合均匀,这时 DNA 在溶液中充分溶解,其它一些杂质析出,过滤取其滤液。3、析出含DNA 的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水,同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌,这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水,溶液中出现的黏稠物会越来
6、越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。4、滤取含DNA 的粘稠物用放多层纱布的漏斗,过滤溶液至 1000 mL 的烧杯中。取纱布上的黏稠物。5、将 DNA的粘稠物再溶解取一个 50 mL 烧杯,向烧杯内注入物质的量浓度为2molL 的 NaCl 溶液 20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至 NaCl 溶液中,用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min,使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。6、过滤含DNA 的氯化钠溶液取一个 100 mL 烧杯,用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液(DNA 溶于滤液中) 。7、提取含杂质较少的 DNA在上述滤过的溶液中,加入冷却的、体积分数为 95的酒精溶液
7、50 mL(加入时动作要慢) ,并作用玻璃棒沿一个方向搅拌,溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时,继续慢慢搅拌,至不再增加时,用玻璃棒将丝状物卷起,并用滤纸吸取上面的水分。8、DNA 的鉴定取两支 20 mL 的试管,各加入物质的量浓度为2molL 的 NaCl 溶液 5mL,将丝状物放入其中一支试管中,用玻璃棒搅拌,使丝状物溶解。然后,向两支试管中各加入 4 mL 的二苯胺 试剂。混合均匀后,将试管置于沸水中加热 5min,等试管冷却后,观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。三、操作提示1、以血液为实验材料时,每 100ml 血液中需要加入 3g 柠檬酸钠,防止血液凝固
8、。2、加入洗涤剂后,动作要轻缓、柔和,否则容易产生大量的泡沫,不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时,动作要轻缓,以免加剧 DNA 分子的断裂,导致 DNA 分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用,否则会影响鉴定的效果。四、课题成果评价1、是否提取出了 DNA观察你提取的 DNA 颜色,如果不是白色丝状物,说明 DNA 中的杂质较多;二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功,如果不呈现蓝色,可能所提取的 DNA 含量低,或是实验操作中出现错误,需要重新制备。2、分析 DNA 中的杂质本实验提取的 DNA 粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖、RNA 等杂质。3、不同实验方法的比较3对于不
9、同的实验方法,本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料,其次同种材料还可以采用不同方法,从多方面比较实验结果,如 DNA 的多少、颜色,二苯胺显色的深浅等,看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。五、课题延伸本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物,在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的 DNA 时,通常使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)或吐温等化学试剂。【教材答案】(一)旁栏思考题1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂?答:蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体,水分可以大量进入血细胞内,使血细胞胀裂,加上搅拌的机械作用,就加速了鸡血细胞的破裂(细胞
10、膜和核膜的破裂),从而释放出 DNA。2加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么?答:洗涤剂是一些离子去污剂,能溶解细胞膜,有利于 DNA 的释放;食盐的主要成分是NaCl,有利于 DNA 的溶解。3如果研磨不充分,会对实验结果产生怎样的影响?答:研磨不充分会使细胞核内的 DNA 释放不完全,提取的 DNA 量变少,影响实验结果,导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分?答:可能含有核蛋白、多糖和 RNA 等杂质。5为什么反复地溶解与析出 DNA,能够去除杂质?答:用高盐浓度的溶液溶解 DNA,能除去在高盐中不能溶解的杂质;用低盐浓度使 DNA析出,能除
11、去溶解在低盐溶液中的杂质。因此,通过反复溶解与析出 DNA,就能够除去与 DNA 溶解度不同的多种杂质。6方案二与方案三的原理有什么不同?答:方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白,从而使提取的 DNA 与蛋白质分开;方案三利用的是 DNA 和蛋白质对高温耐受性的不同,从而使蛋白质变性,与 DNA 分离。例题 1下列关于高中生物学实验的叙述,正确的是A在制备果酒和果醋的实验过程中都要持续通入氧气B分离土壤中不同种类的微生物需采用相同的稀释度C将 DNA 粗提取后用二苯胺进行鉴定时需要进行水浴加热D选择过氧化氢酶作为探究温度对酶活性影响实验的理想材科答案 C例题 2、下列实验材料、用具的改变,对实验结果
12、影响最小的是用二苯胺试剂代替甲基绿染色观察的分布大蒜根尖代替洋葱根尖观察植物细胞有丝分裂0.14mol/LNaCL 代替 2mol/LNaCL 溶解 DNA D蒸馏水代替层析液进行叶绿体色素的分离答 案 .BDNA、RNA 和蛋白质相关术语拓展顺式作用元件(cis-acting element)是指存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等,它们的作用是参与基4因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质,仅仅提供一个作用位点,要与反式作用因子相互作用而起作用。反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶
13、基因转录效率的蛋白质,有时也称转录因子。大多数真核转录调节因子由某一基因表达后,可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用,从而激活另一基因的转录。这种调节蛋白称为反式作用因子。反义脱氧核苷酸就是和 mRNA 链互补的脱氧核苷酸链。可以诱导 mRNA 的降解,导致基因的沉默。反义 RNA 是指与靶 RNA(多为 mRNA)具有互补序列的 RNA 分子,通过与靶 RNA 进行碱基配对结合的方式,参与基因的表达调控。反义核酸是指能与特定 mRNA 精确互补、特异阻断其翻译的 RNA 或 DNA 分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达,使之低表达或不表达,这种技术即为反义核酸技术。例题 1基因转录
14、出的初始 RNA,经不同方式的剪切可被加工成翻译不同蛋白质的mRNA。某些剪切过程不需要蛋白质性质的酶参与。大多数真核细胞 mRNA 只在个体发育的某一阶段合成,不同的 mRNA 合成后以不同的速度被降解。下列判断不正确的是A某些初始 RNA 的剪切加工可由 RNA 催化完成B一个基因可能参与控制生物体的多种性状CmRNA 的产生与降解与个体发育阶段有关D初始 RNA 的剪切、加工在核糖体内完成答案 D例题 2单细胞生物四膜虫转录形成的一种前体 RNA,在仅含核苷酸和纯化的前体 RNA 的溶液中,发生了 RNA 内部部分序列的有序切除。下列相关叙述不正确的是A该 RNA 的基本单位是核糖核苷酸
15、 B该 RNA 的剪切可能是由自身催化的C该 RNA 剪切所需的酶是由自身翻译形成 D该 RNA 的剪切过程会受到温度、pH 的影响答案 C例题 3. (18 分)RNA 具有多种功能,请回答下列与 RNA 有关的问题:(1) 在细胞生物中,DNA 是遗传物质,RNA 帮助其实现功能。其中,RNA 能够帮助_酶合成子代 DNA 分子,实现 DNA_的功能。另外,在遗传信息表达过程中,mRNA 的功能是_,在翻译过程中,_也发挥了关键作用。(2) RNA 一般是单链分子,但也可遵循_原则形成部分双链,再折叠产生复杂的空间结构。同时,与 DNA 相比,RNA 中的五碳糖是_,其分子含有游离的羟基,
16、这两个特点使 RNA 具有催化潜能。(3) 四膜虫体内存在具有剪切底物分子能力的某种 RNA 分子(核酶)。正常情况下,核酶需要 Mg2+的辅助,在实验条件下让核酶处于Ca2 +环境中,进行 RNA 分子群体的选择实验,实验结果如图 21 所示。该结果表明四膜虫产生了在 Ca2+环境中_的核酶,其原因是某些碱基被替换,发生了_,通过_适应环境的个体逐渐增多。5答案 (18 分) (1)DNA 聚合 传递遗传信息(携带遗传信息) 将遗传信息从 DNA 传递给蛋白质 tRNA 和 rRNA(转运 RNA 和核糖体 RNA;tRNA;转运 RNA) (2)碱基互补配对 核糖 (3)催化活性更高(剪切
17、能力更强) 基因突变 选择作用(人工选择;自然选择)例题 4.(18 分)凋亡抑制蛋白与肿瘤的发生、发展有关,科学家利用先天无胸腺的裸鼠,探究凋亡抑制蛋白基因的反义脱氧核苷酸链对肠癌肿瘤的抑制作用。请分析回答下列问题:(1)人工合成部分序列为 5GGCAACACCCAT3反义脱氧核苷酸链,能够与凋亡抑制蛋白基因的_配对结合,使其分子构象发生改变,不能与_结合,抑制翻译。请写出凋亡抑制蛋白基因的部分序列:_。另外,人工合成的序列不应与人类其他基因的碱基序列相同,以避免该序列_。(2)将肠癌细胞置于含 5%_的恒温培养箱中培养,对培养细胞用 0.4%台盼蓝染料染色,拒染率95%,说明绝大部分培养细
18、胞为活细胞,其细胞膜具有_性。将拒染的细胞制成单细胞悬液,每只实验裸鼠接种等量的单细胞悬液于背部皮下,2 周左右成瘤,成瘤率为 100%。成瘤率为 100%的原因是裸鼠_。(3)将若干只生长状况相同的裸鼠等分为两组,对皮下瘤体分别注射适量含_的生理盐水和等量的生理盐水,检测_,计算抑制率,抑制率=(1治疗组瘤重量/对照组瘤重量)100%。若抑制率_,则说明反义脱氧核苷酸链能够明显抑制裸鼠肠癌移植瘤的生长。答案. ( 除 注 明 外 , 每 空 2 分 , 共 18 分 )(1 ) mRNA 核糖体 (见右图)干扰人类其他基因的表达(2 ) CO2(1 分) 选择透过(1 分) 无胸腺,失去特异
19、性免疫,对接种的肠癌细胞没有排斥反应(3 )反义脱氧核苷酸链 瘤体重量 (更加)接近 100%例题 5(18 分)为确定遗传信息从 DNA 传递给蛋白质的中间载体,科学家们做了如下研究。(1) 依据真核细胞中_位于细胞核内,而蛋白质合成在核糖体上这一事实,科学家推测存在某种“信使”分子,能将遗传信息从细胞核携带到细胞质中。(2) 对于“信使”有两种不同假说。假说一:核糖体 RNA 可能就是信息的载体;假说二:另有一种 RNA(称为 mRNA)作为遗传信息传递的信使。若假说一成立,则细胞内应该有许多_(填“相同”或“不同” )的核糖体。若假说二成立,则 mRNA 应该与细胞内原有的_结合,并指导
20、蛋白质合成。(3) 研究发现噬菌体侵染细菌后,细菌的蛋白质合成立即停止,转而合成噬菌体的蛋白质,在此过程中,细菌细胞内合成了新的噬菌体 RNA。为确定新合成的噬菌体RNA 是否为“信使” ,科学家们进一步实验。 15NH4Cl 和 13C-葡萄糖作为培养基中的_和碳源来培养细菌,细菌利用它们合成_等生物大分子。经过若干代培养后,获得具有“重”核糖体的“重”细菌 将这些“重”细菌转移到含 14NH4Cl 和 12C-葡萄糖的培养基上培养,用噬菌体6侵染这些细菌,该培养基中加入 32P 标记的_核糖核苷酸为作为原料,以标记所有新合成的噬菌体 RNA。 将上述被侵染后裂解的细菌进行密度梯度离心,结果
21、如下图所示。由图可知,大肠杆菌被侵染后_(填“合成了”或“没有合成” )新的核糖体,这一结果否定假说一。 32P 标记仅出现在离心管的_,说明_与“重”核糖体相结合,为假说二提供了证据。(4) 若要证明新合成的噬菌体 RNA 为“信使” ,还需要进行两组实验,请选择下列序号填入表格。 新合成的噬菌体 RNA 与细菌 DNA 混合 将新合成的噬菌体 RNA 与噬菌体 DNA 混合 出现 DNA-RNA 杂交现象 出现 DNA-RNA 杂交现象 不出现 DNA-RNA 杂交现象答案.(18 分)(1)DNA(或“ 基因” ) (1 分)(2)不同(2 分) 核糖体(2 分)(3)氮源(1 分) 蛋
22、白质和核酸(2 分) 尿嘧啶(2 分)没有合成(2 分) 底部(1 分) 新合成的噬菌体 RNA(2 分)(4)如右表(3 分)注:1 组与 2 组可整组互换位置,但全部填写正确才可得分。例题 6 (18 分)普通番茄细胞中含多聚半乳糖醛酸酶基因(用 A 表示) ,控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶,该酶能破坏细胞壁,使番茄易软化,不耐储藏。抗多聚半乳糖醛酸组别 实验处理 预期结果12组别 实验处理 预期结果1 2 7酶基因可以使番茄不再产生多聚半乳糖醛酸酶,从而使番茄长时间抗软化,容易储存和运输。下图是通过基因工程培育抗软化耐储藏番茄的过程及原理。请分析回答下列问题:(1)普通番茄(AA)也可以通
23、过_育种的方法,最终获得基因型为 aa(不能合成多聚半乳糖醛酸酶)的抗软化、耐储存的番茄。(2)利用基因工程将目的基因导入植物细胞,目前采用最多的方法是_,该方法中用到的目的基因载体是_,目的基因需插入到该基因载体的_上。(3)将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞所需要的工具酶有_。(4)图 1 中获得导入抗多聚半乳糖醛酸酶基因的番茄细胞,需要经过_技术获得转基因番茄,这个过程需要在 条件下进行,细胞先经脱分化形成_,再形成丛芽和根。(5)根据图 2 分析抗多聚半乳糖醛酸酶基因能使番茄抗软化的原理是两个基因分别转录出的 mRNA_,从而阻断了_过程。答案(除注明外,其余每空 2 分)(1)诱变
24、 (2)农杆菌转化法 Ti 质粒 T-DNA(3)限制酶和 DNA 连接酶(4)植物组织培养(1 分) 无菌 愈伤组织(1 分) (5)结合形成双链RNA 多聚半乳糖醛酸酶基因的表达课题 2 PCR 扩增反应的操作第一节 PCR 扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应(PCR)的基本构成PCR 是聚合酶链式反应的简称,指在引物指导下由酶催化的对特定模板(克隆或基因组 DNA)的扩增反应,是模拟体内 DNA 复制过程,在体外特异性扩增 DNA 片段的一种技术。PCR 基本原理是以单链 DNA 为模板,4 种 dNTP 为底物,在模板 3末端有引物存在的情况下,用酶进行互补链的延伸,多次反复的循环能
25、使微量的模板 DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中,加入与待扩增的 DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的 DNA 膜板、四种 dNTP 溶液、耐热 Taq DNA 聚合酶、Mg 2+等。反应时先8将上述溶液加热,使模板 DNA 在高温下变性,双链解开为单链状态;然后降低溶液温度,使合成引物在低温下与其靶序列配对,形成部分双链,称为退火;再将温度升至合适温度,在 Taq DNA 聚合酶的催化下,以 dNTP 为原料,引物沿 53方向延伸,形成新的 DNA 片段,该片段又可作为下一轮反应的模板,如此重复改变温度,由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期,反复循环
26、,使目的基因得以迅速扩增。因此 PCR 循环过程为三部分构成:模板变性、引物退火、热稳定 DNA 聚合酶在适当温度下催化 DNA 链延伸合成(见图) 。1模板 DNA 的变性模板 DNA 加热到 9095时,双螺旋结构的氢键断裂,双链解开成为单链,称为 DNA的变性,以便它与引物结合,为下轮反应作准备。变性温度与 DNA 中 G-C 含量有关,G-C间由三个氢键连接,而 A-T 间只有两个氢键相连,所以 G-C 含量较高的模板,其解链温度相对要高些。故 PCR 中 DNA 变性需要的温度和时间与模板 DNA 的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高 G-C 含量的模板 DNA 在实验
27、中需添加一定量二甲基亚砜(DMSO) ,并且在 PCR 循环中起始阶段热变性温度可以采用 97,时间适当延长,即所谓的热启动。2模板 DNA 与引物的退火将反应混合物温度降低至 3765时,寡核苷酸引物与单链模板杂交,形成 DNA 模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓度大大高于模板 DNA 的浓度,并由于引物的长度显著短于模板的长度,因此在退火时,引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多,退火时间一般为 12min 。3引物的延伸DNA 模板-引物复合物在 Taq DNA 聚合酶的作用下,以
28、dNTP 为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对与半保留复制原理,合成一条与模板 DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火- 延伸三过程,就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板 DNA 的长度。在 72条件下,Taq DNA 聚合酶催化的合成速度大约为 4060 个碱基 /秒。经过一轮“变性-退火 -延伸”循环,模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中,新合成的 DNA 都可以起模板作用,因此每一轮循环以后,DNA 拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需 24min ,一次 PCR 经过 3040 次循环,约 23h。扩增初期,扩增的量呈直线上升,
29、但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时,酶的催化反应趋于饱和,便出现所谓的“平台效应” ,即靶 DNA 产物的浓度不再增加。PCR 的三个反应步骤反复进行,使 DNA 扩增量呈指数上升。反应最终的 DNA 扩增量可用 Y(1X) n 计算。Y 代表 DNA 片段扩增后的拷贝数,X 表示(Y)平均每次的扩增效率,n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期,靶序列 DNA 片段的增加呈指数形式,随着 PCR 产物的逐渐积累,被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加,而进入线性增长期或静止期,即出现“停滞效应”,这种效应称平台期数。PCR 扩增效率、
30、 DNA 聚合酶的种类和活性、非特异性产物的竟争等因素都会影响平台期数。大多数情况下,平台期的到来是不可避免的。二、PCR 反应的五个元素参与 PCR 反应的物质主要为五种:引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2+。1引物引物是 PCR 特异性反应的关键,PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上,只要知道任何一段模板 DNA 序列,就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物,利用PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。引物设计有 3 条基本原则:首先引物与模板的序列9要紧密互补,其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构,再次引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合
31、反应(即错配) 。引物的选择将决定 PCR 产物的大小、位置、以及扩增区域的 Tm 值。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生,甚至在 RNA-PCR 中也能识别 cDNA 或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量:若使用设计粗糙的引物,产物将很少甚至没有;而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然,即使有了好的引物,依然需要进行反应条件的优化,比如调整 Mg2+浓度,使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保 PCR 的成功,但遵循某些原则,则有助于引物的设计。(1)引物长度PCR 特异性一般通过引物长度和退火温度来
32、控制。引物的长度一般为 15-30bp,常用的是 1827bp,但不应大于 38bp。引物过短时会造成 Tm 值过低,在酶反应温度时不能与模板很好的配对;引物过长时又会造成 Tm 值过高,超过酶反应的最适温度,还会导致其延伸温度大于 74,不适于 Taq DNA 聚合酶进行反应,而且合成长引物还会大大增加合成费用。(2)引物碱基构成引物的 G+C 含量以 4060%为宜,过高或过低都不利于引发反应,上下游引物的 GC含量不能相差太大。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度,即在一定盐浓度条件下,50%寡核苷酸双链解链的温度,有效启动温度,一般高于 Tm 值 510。若按公式 Tm=4(G+C)+2(
33、 A+T)估计引物的 Tm 值,则有效引物的 Tm 为 55 80,其 Tm 值最好接近 72以使复性条件最佳。引物中四种碱基的分布最好是随机的,不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其 3端不应超过 3 个连续的 G 或 C,因这样会使引物在 G+C 富集序列区错误引发。(3)引物二级结构引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模板的结合从而影响引物效率。对于引物的 3末端形成的二聚体,应控制其 G 大于-5.0 kcal/mol 或少于三个连续的碱基互补,因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性,引物中间或 5端的要求可适当放宽。引物自身形成的发
34、卡结构,也以 3端或近 3端对引物-模板结合影响更大;影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外,与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量避免 3末端有发卡结构的引物。(4)引物 3端序列引物 3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的,而引物 3末端最后 5 到 6 个核苷酸的错配应尽可能的少。如果 3末端的错配过多,通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果,反应几乎注定要失败。引物 3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补,尤其是在 3末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现,这样获得的 PCR 产物其实是引物自身的扩增。这将会
35、在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争 PCR 状态,从而影响扩增成功。引物 3末端的稳定性由引物 3末端的碱基组成决定,一般考虑末端 5 个碱基的G。 G 值是指 DNA 双链形成所需的自由能,该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性,此值的大小对扩增有较大的影响。应当选用 3端G 值较低(绝对值不超过 9) ,负值大,则 3末端稳定性高,扩增效率更高。引物的 3端的 G 值过高,容易在错配位点形成双链结构并引发 DNA 聚合反应。10需要注意的是,如扩增编码区域,引物 3端不要终止于密码子的第 3 位,因密码子的第 3 位易发生简并,会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为 A 的错配效率明
36、显高于其他 3 个碱基,因此应当避免在引物的 3端使用碱基 A。(5)引物的 5端引物的 5端限定着 PCR 产物的长度,它对扩增特异性影响不大。因此,可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物 5端修饰包括:加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合 DNA 序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两个酶切位点,应在后续方案设计完毕后确定,便于后期的克隆实验,特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。(6)引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过 70%或有连续 8 个互补碱基同源,特别是与待扩增的模板 DNA 之间要没有明显的相似序
37、列。2酶及其浓度Taq DNA 多聚酶是耐热 DNA 聚合酶,是从水生栖热菌(Thermus aquaticus )中分离的。Taq DNA 聚合酶是一个单亚基,分子量为 94 000 Da。具有 53 的聚合酶活力,53的外切核酸酶活力,无 35的外切核酸酶活力,会在 3末端不依赖模板加入 1 个脱氧核苷酸(通常为 A,故 PCR 产物克隆中有与之匹配的 T 载体) ,在体外实验中,Taq DNA 聚合酶的出错率为 10-410 -5。此酶的发现使 PCR 广泛的被应用。此酶具有以下特点:(1)耐高温,在 70下反应 2 小时后其残留活性在 90%以上,在 93下反应 2 小时后其残留活性是
38、仍能保持 60%,而在 95下反应 2 小时后为原来的 40%。(2)在热变性时不会被钝化,故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。(3)一般扩增的 PCR 产物长度可达 2.0 kb,且特异性也较高。PCR 的广泛应用得益于此酶,目前各试剂公司中开发了多种类型的 Taq 酶,有用于长片段扩增的酶,扩增长度极端可达 40kb;有在常温条件下即可应用的常温 PCR 聚合酶;还有针对不同实验对象的酶等。一典型的 PCR 反应约需的酶量为 2.5u(总反应体积为 50l 时) ,浓度过高可引起非特异性扩增,浓度过低则合成产物量减少。3dNTP 的质量与浓度dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率
39、有密切关系,dNTP 粉呈颗粒状,如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性,使用时应配成高浓度后,以 1M NaOH 或 1M Tris。HCl 的缓冲液将其 pH 调节到 7.07.5,小量分装,-20 冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在 PCR 反应中, dNTP 应为 50200 mol/l,尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等(等摩尔配制) ,如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低) ,就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合,使游离的 Mg2+浓度降低。4模板(靶基因)核酸模板核酸的量与纯化程度,是 PCR 成败
40、与否的关键环节之一,传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是:溶解细胞膜上的脂类与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜,并解离细胞中的核蛋白,SDS 还能与蛋白质结合而沉淀;蛋白酶 K 能水解消化蛋白质,特别是与 DNA 结合的组蛋白,再用有机溶剂(酚与氯仿抽)抽提除去蛋白质和其它细胞组份,用乙醇或异丙醇沉淀核酸,该核酸即可作为模板用于 PCR 反应。一般临床检测标本,可采用快速简便的方法溶解细胞,裂解病原体,消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离,直接用于 PCR 扩增。11模板 DNA 投入量对于细菌基因组 DNA 一般在 110ng/l,实验
41、中模板浓度常常需要优化,一般可选择几个浓度梯度(浓度差以 10 倍为一个梯度) 。在 PCR 反应中,过高的模板投入量往往会导致 PCR 实验的失败。5Mg 2+浓度Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响,在一般的 PCR 反应中,各种 dNTP 浓度为 200mol/l 时,Mg 2+浓度为 1.52.0mmol/l 为宜。Mg 2+浓度过高,反应特异性降低,出现非特异扩增,浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性,使反应产物减少。一般厂商提供的 Taq DNA 聚合酶均有相应的缓冲液,而 Mg2+也已添加,如果特殊实验应采用无 Mg2+的缓冲液,在 PCR 反应体系中添加一
42、定量的 Mg2+。三、PCR 反应特点PCR 反应具有以下特点:1强特异性PCR 反应的特异性决定因素为:( 1)引物与模板 DNA 特异性的结合;(2)碱基配对原则;(3)Taq DNA 聚合酶合成反应的忠实性;(4)靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键,引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及 Taq DNA 聚合酶耐高温性,使反应中模板与引物的结合( 复性 )可以在较高的温度下进行,结合的特异性大大增加,被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区,其特异性程度就更高。2高灵敏度PCR 产物的生成量是
43、以指数方式增加的,能将皮克( pg=10-12g)量级的起始待测模板扩增到微克( g = 10-6g)水平。能从 100 万个细胞中检出一个靶细胞;在病毒的检测中,PCR 的灵敏度可达 3 个 RFU(空斑形成单位) ;在细菌学中最小检出率为 3 个细菌。3快速简便PCR 反应用耐高温的 Taq DNA 聚合酶,一次性地将反应液加好后,即在 PCR 仪上进行变性退火延伸反应,反应一般在 24 小时完成。扩增产物常用电泳分析,操作简单易推广,如采用特殊 PCR 仪(荧光时时定量 PCR 仪)则可全程监测 PCR 反应的结果,故耗时将更短。4低纯度模板不需要分离病毒或细菌及培养细胞,DNA 粗制品
44、及总 RNA 等均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的 DNA 扩增检测。例题 1下列过程不属于克隆的是A单个大肠杆菌形成单菌落 B壁虎断尾后长出新尾巴CPCR 扩增抗除草剂基因 D利用柳树枝条繁殖植株答案B第二节 PCR 扩增反应的实施一、PCR 反应的条件PCR 反应条件为温度、时间和循环次数。1温度与时间的设置基于 PCR 原理三步骤而设置变性 -退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法,双链 DNA 在 9095变性,再迅速冷却至 4060 ,引物退火并结合到靶序列上,然后快速升温至 7075,在 Taq DNA 聚合酶的作用下,使
45、引物链沿模板延伸。对于较12短靶基因(长度为 100300bp 时)可采用二温度点法,除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一,一般采用 94变性,65左右退火与延伸(此温度 Taq DNA 酶仍有较高的催化活性) 。(1 )变性温度与时间:变性温度低,解链不完全是导致 PCR 失败的最主要原因。一般情况下,93 94 lmin 足以使模板 DNA 变性,若低于 93则需延长时间,但温度不能过高,因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或 PCR 产物完全变性,就会导致 PCR 失败。(2 )退火(复性)温度与时间:退火温度是影响 PCR 特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至 4
46、060 ,可使引物和模板发生结合。由于模板 DNA 比引物复杂得多,引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。退火温度与时间,取决于引物的长度、碱基组成及其浓度,还有靶基序列的长度。对于 20 个核苷酸,G+C 含量约 50%的引物,55 为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度:Tm 值(解链温度)=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm 值-(510)在 Tm 值允许范围内,选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合,提高 PCR 反应的特异性。复性时间一般为 3060sec ,足以使引物与模板之间完全结合。(3 )延伸温
47、度与时间:Taq DNA 聚合酶的生物学活性:70 80,150 核苷酸/S/酶分子;70,60 核苷酸/S/酶分子; 55,24 核苷酸/S/酶分子;高于 90时,DNA 合成几乎不能进行。(4 ) PCR 反应的延伸温度一般选择在 7075之间,常用温度为 72,过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR 延伸反应的时间,可根据待扩增片段的长度而定,一般 1kb 以内的 DNA 片段,延伸时间 1min 是足够的。3 4kb 的靶序列需 34min ;扩增 10kb 需延伸至 15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增,延伸时间要稍长些。2循环次数循环次数决定 PCR 扩增程度。PCR 循环次数主要取决于模板 DNA 的浓度,一般的循环次数选在 30 40 次之间,循环次数越多,非特异性产物的量亦随之增多。二、PCR 扩增产物分析PCR 产物是否为特异性扩增,其结果是否准确可靠,必须对其进行严格的分析与鉴定,才能得出正确的结论。PCR 产物的分析,可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。1凝胶电泳分析:PCR 产物电泳, EB 溴乙锭染色紫外仪下观察,初步判断产物的特异性。PCR 产物片段的大小应与预计的一致