1、实验六 微生物(细菌)基因组DNA的提取,一、实验原理,1、核酸的分类,DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,分离纯化核酸总的原则：应保证核酸一级结构的完整性；排除其它分子的污染。 核酸纯化应达到的要求：核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；其它生物大分子的污染应降低到最低程度；排除其它核酸分子的污染。,2、核酸制备的一般原则,一、
2、实验原理,核酸制备时应注意的事项:尽量简化操作步骤，缩短提取过程。减少化学因素对核酸的降解。减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温防止核酸的生物降解。,3、核酸制备的一般原则,一、实验原理,核酸制备的步骤：,破碎细胞,提取,纯化,I.材料准备II.破碎细胞或包膜内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,核酸酶的抑制和抑制剂降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉
3、断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,4、核酸制备的一般方法和原理,一、实验原理,核酸酶的抑制和抑制剂DNase抑制加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。,核酸酶的抑制和抑制剂RNase抑制操作要带手套。所有器皿要严格消毒，试剂处理低温操作在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。,核酸制备中常用的去垢剂核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用：1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂；2溶解核
4、糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来；3对RNase、DNase有一定的抑制作用。,如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠,核酸制备中常用的蛋白质变性剂 蛋白质变性剂的作用：1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。,如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,核酸制备中常用的酶DNaseRNase蛋白酶K溶菌酶,核酸提取的一般过程 1）破碎细胞（防止核酸酶的作用）微生物：溶菌酶、SDS裂解。高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。酶法
5、：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。动物：液氮处理后用匀浆器破碎。细胞器DNA：首先纯化细胞器。以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂,核酸提取的一般过程 2）破碎抽提核酸除去杂质1首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋白与 其它成分分离2使核酸与蛋白质分离3除去脂类 4多糖的除去,核酸提取的一般过程3）核酸的纯化根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核酸样品。,4）核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是温度和介质温度：4（5）最佳和最简单-70是长期保存的良好温度，为一次性保存-20保存保存介质： TE缓
6、冲溶液(最常用)10mmol/L Tris-Cl pH8.01mmol/L EDTA pH8.0,二、材料、设备及试剂,菌种 ：细菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器 试剂：TE缓冲液、10%（w/v）十二烷基硫酸钠（SDS）、20mg/ml蛋白酶K、5mol/L NaCl溶液、CTAB/ NaCl溶液、24：1氯仿/异戊醇、25：24：1酚/氯仿/异戊醇、异丙醇、70%乙醇 、,1培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.5ml的培养物12000rpm离心5min。 2沉淀物加入567l 的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重
7、悬。加入30l 10%的SDS和3l 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37温育0.5h。 3加入100l 5 mol/L NaCl，充分混匀，再加入80l CTAB/ NaCl溶液，混匀，于65温育10min。,三、操作步骤,4加入等体积的氯仿异戊醇，混匀，10000*g，离心4min。将上清液转入一个新管中。 5加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀， 10000*g,离心5min，将上清转入一只新管中。 6加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来 ， 12000*g,离心5分钟，去上清，用 70%乙醇洗涤。 77500*g,离心5min，弃上清，自然干燥，重溶于30l 的TE缓冲液。
8、,四、注意事项材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集,四、注意事项细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡,四、注意事项核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔离心分离两相时，应
9、保证一定的转速和时间,四、注意事项核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀 沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发（不要过分干燥） 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应 DNA中残留有金属离子,重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质 重新沉淀DNA，让酒精充分挥发 增加70乙醇洗涤
10、的次数（2-3次）,五、DNA提取常见问题,问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。,原因,对 策,材料不新鲜或反复冻融 未很好抑制内源核酸酶的活性 提取过程操作过于剧烈，DNA被机械打断 外源核酸酶污染 反复冻融,尽量取新鲜材料，低温保存材料避免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时，可增加裂解液中螯合剂的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免反复冻融,问题二：DNA降解,对 策,原因,五、DNA提取常见问题,实验材料不佳或量少 破壁或裂解不充分 沉淀不完全 洗涤时DNA丢失,尽量选用新鲜（幼嫩）的材料 动植物要匀浆研磨充分；G菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁 高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量） 低温沉淀，延长沉淀时间 加辅助物，促进沉淀 洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒,问题三：DNA提取量少,对 策,原因,五、DNA提取常见问题,1简要叙述酚氯仿抽提体系后出现的现象及其成因。沉淀时为什么要用无水乙醇？,六、问题与讨论,
