1、实验三 动物组织基因组 DNA的提取 王翠芳 2017-3-29 实验目的 1. 实验原理（核酸分离纯化） 2. 实验仪器、试剂和耗材 3. 实验步骤 4. 实验结果与讨论 5. 动物组织基因组 DNA的提取 一、实验目的 从小鼠尾巴中提取纯的基因组DNA; 掌握基因组 DNA抽提的办法 ，理解核酸分离纯化的基本原理； 二、实验原理 DNA： 主要存在于细胞核的染色体中 。 核外也有少量 DNA， 如线粒体 DNA（ mtDNA） 、 叶绿体 DNA（ cpDNA） ， 质粒 DNA。 RNA： 存在于细胞质中 ， 如 mRNA， rRNA，tRNA等 。 1、核酸的分类 二、实验原理 分离纯
2、化核酸总的原则： 应保证核酸一级结构的完整性； 排除其它分子的污染； 核酸纯化应达到的要求： 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 其它生物大分子的污染应降到最低程度； 排除其它核酸分子的污染； 2、核酸制备的一般原则 二、实验原理 核酸制备时应注意的事项： 尽量简化操作步骤 ， 缩短提取过程； 减少化学因素对核酸的讲解； 减少物理因素的核酸的讲解：机械剪切力和高温； 防止核酸的生物讲解； 2、核酸制备的一般原则 二、实验原理 降低温度 ， 改变 pH值 ， 及盐的浓度 ， 都利于对核酸酶活性的抑制 ， 但均不如用核酸酶抑制剂更有利 ， 几个条件并用更好 。 DNA
3、， 抑制 Dnase活力很容易 ， 但 防止机械拉力张力更重要 ； RNA， 因分子较小 ， 不易被机械张力拉断 ， 但抑制 Rnase活力较难 ， 故在 RNA提取中设法抑制Rnase更重要 。 3、核酸酶的抑制和抑制剂 二、实验原理 Dnase抑制： 加入少量金属离子螯合剂 ， 如 0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠 ， Dnase基本可以全部失活； 去垢剂 、 蛋白变性剂及 Dnase抑制剂也可使Dnase失活； 3、核酸酶的抑制和抑制剂 二、实验原理 RNase抑制： 操作要带手套； 所有器皿要严格消毒； 试剂处理； 低温操作； 在分离过程中要加入一定的 Rnase抑制剂 3、核
4、酸酶的抑制和抑制剂 二、实验原理 4、核酸制备中常用的 去垢剂 核酸本身带负电荷 ， 结合带正电荷的蛋白质 ，用于核酸提取的去垢剂一般都是阴离子去垢剂 ，去垢剂的作用： 溶解膜蛋白及脂肪 ， 使细胞膜破裂； 溶解核糖体上面的蛋白 ， 使其解聚 ， 将核酸释放出来； 对 Rnase和 Dnase有一定的抑制作用； 如 : SDS， 脱氧胆酸钠 ， 4-氨基水杨酸钠 ， 萘 -1，5-二磺酸钠 等 二、实验原理 5、核酸制备中常用的蛋 白质变性剂 蛋白质变性剂的作用： 使蛋白质变性 、 沉淀 ， 从核酸提取液中分离除去 ， 以防造成蛋白质污染； 使蛋白质变性 ， 故可使核糖体解聚释放出核酸； 某些
5、蛋白质变性剂也可抑制 Rnase活性和破裂细胞的作用； 如： 苯酚 、 氯仿 、 盐酸胍 、 DEPC 二、实验原理 6、核酸制备的步骤 破碎细胞 提取 纯化 二、实验原理 6、核酸制备的步骤 破碎细胞 微生物：溶酶菌 、 SDS裂解； 高等植物：捣碎器破碎 、 液氮研磨 。 酶法 蛋白酶 、 胰蛋白酶； 冰冻法 反复冻融或液氮冻后组织捣碎； 动物：液氮处理后用匀浆器破碎； 以上处理时均要 加入核酸酶抑制剂 。 二、实验原理 6、核酸制备的步骤 首先使脱氧核糖核蛋白 、 核糖体 、病毒的核蛋白与其它成分分离； 使核酸与蛋白质分离； 除去脂类； 多糖的除去； 破碎细胞 提取 二、实验原理 6、核
6、酸制备的步骤 根据所需核酸的性质和特点除去其它核酸污染 ， 并除去其它提取过程中的一系列试剂 （ 盐 、 有机溶剂等 ） 杂质 ，最后得到均一的核酸样品 。 破碎细胞 提取 纯化 二、实验原理 7、核酸样品的保存 核酸保存的主要条件是 温度 和 介质 温度： 4 最佳最简单； -70 长期保存的良好温度； -20 ； 保存介质： TE缓冲液 （ 最常用 ） 10mmol/L Tris-HCl pH 8.0 1mmol/L EDTA pH 8.0 三、实验试剂、仪器和耗材 材料： 小鼠尾巴 仪器： 离心机、各种规格移液器、无菌移液器吸头、分光光度计 试剂： 组织基因组 DNA提取试剂盒 无水乙醇
7、 四、实验步骤 在液氮中将组织块研磨粉碎； 取不多于 50 mg磨碎的组织 ， 放入 1.5或 2.0 ml离心管中 。 注意：样本的磨碎程度将影响裂解效果 。 加入 600ul的 FL Buffer和 10ul PK solution， 混合均匀 。 注意混合充分将有助于裂解 。 于 56 温浴 15min（ 如果组织较难裂解完全 ， 可以适当延长温浴时间 ， 甚至过夜 ） 。 然后 14000g离心 3min。 取 500ul上清液 ， 至新的 2.0ml离心管中 。 四、实验步骤 加入 700ul binding buffer和 300ul无水乙醇 ， 颠倒混匀； 将混合液转移至 Spi
8、n Colomn。 于 10000g离心1min， 并弃去接液管中的液体 。 由于混合液体积大于 750ul， 请分两次离心过柱 。 向 Spin colomn中加入 500ul的 PW Buffer。 于10000g离心 30s， 并弃去接液管中液体 。 向 Spin colomn中加入 600ul的 Wash Bufer。 于10000g离心 30s， 并弃去接液管中液体 。 重复实验步骤 9。 四、实验步骤 11 再次将 Spin Colomn于 10000g离心 1min， 并将Spin Colomn转移至一个新的 1.5ml离心管； 12 向 Spin colomn中加入 100ul-200ul Elution Buffer, 并于室温放置 1min。 13 10000g离心 1min， 并弃去 Spin Colomn, 1.5 ml离心管中液体含有 DNA。 五、实验结果 检测 DNA的浓度和质量： 取出一部分的 DNA， 用 elution buffer稀释到一定的倍数 ， 用紫外分光光度计分别测定 OD260， OD280，OD320. DNA浓度 : （ ug/ml） = 50 x OD260 x 稀释倍数 DNA质量 : 2.0 OD260-320/OD280-320 1.7 注意： 1.0 OD260 0.1
