1、载体构建,推荐：分子克隆实验指南第一章,要学的东西,根据自己的需要怎样选择合适的载体 构建载体要注意的要点 载体构建的过程 载体构建中会出现的问题及解决方法,载体构建过程,确定目的设计引物（带上相应的酶切位点）PCR（gDNA或cDNA）连T载体转大肠杆菌（蓝白斑筛选菌落PCR,提质粒做酶切验证）测序表达载体和连到T载体上的片段同时酶切酶连转大肠杆菌（抗性筛选，菌落PCR,提质粒做酶切验证）OK,一、载体的选择,克隆载体,时空表达载体,时空表达载体,超表达载体,超表达载体,回补载体,RNAi载体,改造的P-super1300,GFP Flag myc,亚细胞定位载体,亚细胞定位载体,原核表达载
2、体,原核表达载体,二、引物设计,根据实验的目的来设计所需要的引物 1、半定量 2、定量 3、载体构建 需要的软件：Primer premier、Gene tool、DNAman http:/quantprime.mpimp-golm.mpg.de/,1 atggcggacg cggacggggg ctcgaacctg gcggtgctgg acgcgctgga ctcggcgcgc61 acgcagatgt accacatgaa ggcgatcgtg atcgccggca tgggcttctt caccgacgcc121 tacgacctgt tctgcatctc cacggtgtcc aag
3、ctgctcg gccgtctcta ctaccagccc181 gatggctcga cggacagtaa gccaggcgct ctgtccaaga ccgccaacaa catggtcatc241 ggcgtcgcgc tcgtcggcac gctcatgggc cagcttgtct tcggctactt cggcgacaag301 ctcggccgga agcgcgtcta cggcgtcacc ctcatcctga tggccgcctg cgccatcggc361 tccggcctgt cgttcggcag ctcgcgcaag gcagtcatcg gcacgctgtg cttct
4、tccgc421 ttctggctcg gcttcggcat cggcggggac tacccgctgt cggccaccat catgtccgag481 tactcaaaca agaagacgcg cggcgcgttc atcgccgcgg tgttcgccat gcagggcgtc541 ggcatcatct tcgcggggct cgtgtccatg atcgtctcta gcatcttcct cacctacaac601 aaggcgccgt cgtacaaggg gaaccatgac ctctcgaggc agatgcccgc ggctgactac661 gtgtggcgca tcgt
5、cctgat gatcggcgcg ttcccggcgt tggcgacctt ctactggcgg721 atgaagatgc cggagacggc gaggtacacg gcgatcatcg atggcaacgc gaagcaggcg781 gcgaacgaca tgcagaaggt gctgtcgatc gagatagagg ccgagcagga gaagctggcc841 aagttcaacg cggccaacaa ctacccgctc ctgtcgatgg agttcgcccg gcgccacggc901 ctgcacctca tcggcacgac gaccacgtgg ttcctc
6、cttg acatcgcctt ctacagccag961 aacctgaccc agaaggacat cttcccggct atgggcctga tcagcggcgc tgccgaagtc1021 aacgctctca cggagatgtt ccagatatcc aaggcctcgt tcctcgtcgc tctcctcggc1081 accttccccg gctactgggt caccgtcgct ctcatcgaca agatgggcag gtacgtacga1141 accgtataaa catggacact tgatgcaaat gcaatcgatg cgaacataca cgaaa
7、tgaat1201 gaattcatgg tcacatatgc aggtacatga tccagctgat cggtttcttc atgatgtcca1261 tgttcatgct ggcgatgggc atcctgtacg actacctcaa aacccatcac ttcctgttcg1321 ggctcctgta cgcgctcact ttcttcttcg ccaacttcgg gccgaacagc accaccttcg1381 tgctgccggc cgagctgttc ccgacgcgcg tgcgctccac ctgccacgcc atcagtgccg1441 cggcgggcaa
8、 ggcsggcgcc atcgtcgcgg ccttcggcat tcagaagctc acgtacaact1501 ctcaagtcaa aagcatcaag aaggcgctca tcatcctctc catcaccaac atgctcggct1561 tcttcttcac gttcctcgtc ccggagacca tgggtcggtc gctcgaggag atctccggcg1621 aggacggcaa caccggcgcc ggtggcggcg gcgcccctgc cgctgccaat gccggcgttg1681 gcgtgagcgc ttcggatgtg agcaggga
9、cg agaagttccc tgcttcaagc accgaatggc1741 agacatccat gcacgcatga tacgctcatc tgggatatgc atacctacac aataccagta1801 cgtataccta cgcaataata gtactatatt gatatatctg tattatgaga gtggaaatgg1861 accaaaataa tggcaataac ttgaattgcc agatgctagc ttgggaattt gatatacaag1921 tatatatctc cattaccatg ttagagtaat atatatgttt gagtgt
10、gtgc actcatgcaa1981 caatagtata tatcgtgacc attcacaatg ttgagaacta ctagctagca agaaactgag2041 aatgagaggg acaatgcaac tatgctcctt ttactacttc,注意要点,构建载体的目的要明确： 组织表达，亚细胞定位，超表达，回补，RNAi, 异源系统表达蛋白 （回补载体的启动子；超表达载体的启动子；GFP融合蛋白和his融合蛋白载体构建注意点（去掉终止密码子，防止遗码现象；RNAi载体构建）,酶切位点的选择要注意： 粘性末端： 平末端： 没有合适的酶切位点怎么办？,研究方法,载体构建过程
11、,大肠杆菌感受态,低浓度的钙离子和细胞膜表面的磷脂成分形成羟基-钙磷酸复合物,DNA分子会吸附于表面,当42度热冲击时细胞吸收其表面的的DNA到胞内,完成转化过程. CaCl2、 RuCl等化学试剂法感受态细胞：处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。,-互补现象：,半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚由互补产生的D半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。)基因的失活，破坏位点，当插入
12、一个外源DNA片段时，会造成LacZ失活,质粒提取的方法原理,1溶液I溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中pH小于8时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用（DNase作用时需要一定的金属离子作辅基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因为溶菌酶的反应要求有较低的离子强度的环境。,2溶液IINaOHSDS液： NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是稳定的。但当
13、pH12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解离而变性。在溶液II中的NaOH浓度为0.2mo1L，加抽提液时，该系统的pH就高达12.6，因而促使染色体DNA与质粒DNA的变性。 SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：（1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜。（2）解聚细胞中的核蛋白。（3）SDS能与蛋白质结合成为R-O-SO3-R-蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去除干净，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA时）受到干扰。,3. 溶液III-3molL NaAc（pH4.8）溶液： NaAc的水溶液呈碱性，为了调节pH至4.8，必须加入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是为了把pH12.6的抽提液，调回pH至中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。而高盐的3molL NaAc有利于变性的大分子染色体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉淀之。前者是因为中和核酸上的电荷，减少相斥力而互相聚合，后者是因为钠盐与SDS蛋白复合物作用后，能形成较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。,时间,讲完了！,
