1、氨基酸与蛋白质一级结构,核 糖 体,核糖体是合成蛋白质的细胞器,它的主要成分是蛋白与 RNA,其唯一的功能是按照mRNA的指令用氨基酸合成多肽链。,The endomembrane system（内膜系统） Manufacture and distribution of cellular products（细胞产物的生产和组装）,Endoplasmic recticulum（内质网） The Golgi apparatus （高尔基体） Lysosomes （溶酶体） Vacuoles （液泡）,生物膜,细胞膜细胞器膜,Endoplasmic recticulum 内质网,蛋白质的合成,脂类的
2、合成,蛋白质的修饰,新生多肽的折叠与组装,内质网功能,形态结构,功能,高 尔 基 体,电镜下的高尔基体,是细胞内物质运输的交通枢纽 完成分泌蛋白质的最后加工和折叠,蛋白质修饰与加工（糖基化等） 蛋白质的分拣 蛋白质和脂的运输 蛋白质分泌等多糖合成（如粘液）,高尔基体功能,2.1 氨基酸结构和分类,2.1.1 Amino acid structure氨基酸结构,-碳原子(分子中的第二个碳）不对称碳原子（手性碳原子、不对称中心或手性中心）,Stereoisomers,在空间各原子有两种排列方式：L构型与D构型，它们的关系就像左右手的关系，互为镜像关系,2.1.2 氨基酸分类,The standar
3、d 20 amino acids differ only in the structure of the side-chain or R group.20种氨基酸可根据侧链基团的化学结构分为脂肪族氨基酸（6种）、芳香族氨基酸（3种）、羟基氨基酸（2种）、碱性氨基酸(3种）、酸性氨基酸（2种）和酰胺氨基酸（2种），共七大类氨基酸。,Hydrophobic, aliphtic amino acids 疏水的脂肪族氨基酸,甘氨酸 （Gly,G）,丙氨酸 （Ala,A）,缬氨酸 （Val,V）,亮氨酸 （Leu,L）,异亮氨酸 （Ile,I）,-imino acid: -亚氨基酸,脯氨酸 Prolin
4、e: 与一般的-氨基酸不同,没有自由的-氨基,可以将它视为是-氨基酸的侧链取代了自身氨基上的一个氢原子而形成的杂环结构.,Aromatic amino acids 芳香族氨基酸,苯丙氨酸 （Phe,F）,酪氨酸 （Tyr,Y）,色氨酸 （Trp,W）,含硫氨基酸 (蛋氨酸，半胱氨酸 containing sulfur amino acids,Polar, uncharged amino acids 极性,不带电荷的氨基酸,丝氨酸 （Ser,S）,苏氨酸 （Thr,T）,Polar, charged amino acids 碱性氨基酸,赖氨酸 （Lys,K）,精氨酸 （Arg,R）,组氨酸 （H
5、is,H）,酸性氨基酸天冬氨酸 谷氨酸酰胺氨基酸 天冬酰胺 谷酰胺,2.2 氨基酸的酸碱特性,氨基酸的两性解离性质及等电点（pI）,pH = pI净电荷=0,pH pI 净电荷为正,pH pI 净电荷为负,(pK1),(pK2),当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)。,甘 氨 酸 滴 定 曲 线,甘氨酸盐酸盐（A+）,等电点甘氨酸（A）,甘氨酸钠（A-）,2.4 肽,一分子氨基酸的羧基和一分子氨基酸的氨基脱水缩合形成的酰胺键，即-CO-NH-，
6、称为肽键 （peptide bond)。 氨基酸缩合的产物称为肽（peptide)。,肽键,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。在大多数情况下，以反式结构存在。则包括连接肽键两端的CO、NH和2个C共6个原子的空间位置处在一个相对接近的平面上，而相邻2个氨基酸的侧链R又形成反式构型，从而形成肽键与肽链复杂的空间结构。,谷胱甘肽缩宫素和血管升压素胰岛素阿斯巴甜（天冬氨酰苯丙氨酸甲基酯）,蛋白质结构的主要层次,Primary structure,Secondary structure,Tertiary structure,Quariernary structure,2.5 蛋白质的一级
7、结构 primary structure,The primary level of structure in a protein is the linear sequence of amino acids as joined together by peptide bonds. This sequence is determined by the sequence of nucleotide bases in the gene encoding the protein.,镰刀型红细胞贫血病 （蛋白质一级结构改变导致功能改变）,通过蛋白质一级结构的比较可以揭示 进化关系,2.6蛋白质纯化与分析,
8、Protein purification & analyses,Principle of protein purification,Solubility 溶解度 Size 分子大小 Charge 电荷 Specific binding affinity 特殊结合亲和性,Chromatographic techniques 层析技术 离子交换 ion exchange 凝胶过滤 gel filtration 亲和层析 affinity chromatography 疏水相互作用层析 hydrophobic interaction chromatographyElectrophoretic tec
9、hnique 电泳技术 等电聚焦 isoelectric focusing 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳 SDS-PAGE 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 native-PAGE,2.6.1 柱层析 column chromatography,Ion-exchange chromatography离子交换层析Gel filtration chromatography 凝胶过滤层析Affinity chromatography 亲和层析,Ion-exchange chromatography separation based upon the overall charge of the molec
10、ules,Gel filtration chromatography / size exclusion chromatography / molecular sieve chromotography,Affinity chromatography separation by specific binding interactions between column matrix and target proteins,Lys, Leu, Glu三种氨基酸混合物要通过阳离子交换层析分离，使用pH3.5的阳离子交换柱，缓冲液也是pH 3.5，哪一种氨基酸会从柱上洗脱，是否还需要其他步骤洗脱氨基酸？,
11、蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。一般凝胶介质中的pH维持在碱性区，目的是使大多数蛋白质带有负电荷，这样它们可以向阳极迁移。蛋白质迁移与蛋白质的分子量和多带电荷多少有关。,PAGE polyacrylamide gel electrophoresis聚丙烯酰胺 凝胶 电泳 SDS-PAGE 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳,1. SDS-PAGE,2. 双向电泳,双向电泳是一种将等电聚焦电泳（IFE）与SDS-PAGE结合在一起从而分辨率更高的一种电泳。水平方向反映出蛋白质在等电点上的差异
12、垂直方向反映出它们在相对分子质量上的差异,等电聚焦,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,2. 双向电泳,双向电泳后期分析-质谱鉴定,2.7蛋白质测序 Protein sequencing,确定蛋白质由几条多肽组成 确定每条多肽链的N末端和C末端氨基酸残基 测定多肽链的氨基酸组成 测定肽段氨基酸序列 给出整个氨基酸序列 确定二硫键位置,蛋白质一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。,(1)多肽链的拆分。 由多条多肽链组
13、成的蛋白质分子，必须先进行拆分。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(1)多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,蛋白质一级结构的测定,(2)测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。,蛋白质一级结构的测定,测定步骤,(3)二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基
14、，以防止它重新被氧化。,蛋白质一级结构的测定,可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,蛋白质一级结构的测定,(4)测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比；,蛋白质一级结构的测定,2，测定步骤,(5)分析多肽链的N-末端和C-末端。,蛋白质一级结构的测定,多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。,末端基氨基酸测定,Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）
15、。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。,末端基氨基酸测定,二硝基氟苯（DNFB）法,在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,末端基氨基酸测定,丹磺酰氯法,氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解
16、以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。,末端基氨基酸测定,氨肽酶法,羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,末端基氨基酸测定,羧肽酶法,2测定步骤,(6)多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。,蛋白质一级结构的测定,
17、酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶,多肽链的选择性降解,酶解,目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种：,Trypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。,水解位点,胰蛋白酶,胰凝乳蛋白酶Chymotrypsin：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr;,水解位点,糜蛋白酶,Pepsin：R1和R2均要求为疏水氨基酸。专一性与糜蛋白酶相
18、似,但其最适pH为2,后者为8-9,水解位点,胃蛋白酶,thermolysin：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。,水解位点,嗜热菌蛋白酶,分别从肽链羧基端和氨基端水解,肽链,水解位点,羧肽酶和氨肽酶, 化学法：(Cyanogen bromide) 溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,多肽链的选择性降解,(7)测定每个肽段的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N
19、-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,Edman氨基酸顺序分析法,(8)确定肽段在多肽链中的次序。利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。,蛋白质一级结构的测定,(9)确定原多肽链中二硫键的位置。,蛋白质一级结构的测定,一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链， 再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析， 然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,二硫键位置的确定,请根据下列信息确定一个十肽序列,1摩尔十肽经过一轮Edman降解后产生两摩尔PTH-Asp 用2-巯基乙醇处理该十肽，然后再用胰蛋白酶处理产生三组肽段：Ala, Cys, PheArg, AspAsp, Cys, Gly, Met, Phe 其中第一组肽段经第一轮Edman降解产生 PTH-Cys 1摩尔十肽经羧肽酶处理产生两摩尔Phe 第三组肽段与溴化氰反应产生两组肽段（肽酰高Ser内酯,Asp)和（Cys，Gly，Phe），其中第二组经Edman降解产生PTH-Gly。,
