1、蛋白质的结构 （structure of protein）,为研究的方便，可将蛋白质的结构分为两类： 初级结构（primary structure）:即一级结构，蛋白质的最基本结构； 高级结构（ advanced structure ）又称为三维结构、立体结构、空间结构、构象 二级结构（secondary structure） 三级结构(tertiary structure) 四级结构(quaternary structure) 初级结构与高级结构的关系:一级结构决定高级结构,第3节 蛋白质的一级结构 （primary structure of proteins）,1 蛋白质一级结构的概念（c
2、oncept of proteins primary structure ） 2 蛋白质一级结构的例子胰岛素（ insulin） 3 蛋白质一级结构的测定 4 蛋白质的一级结构与功能的关系 5 肽与蛋白质的人工合成（自学）,蛋白质一级结构的概念 （concept of proteins primary structure)）,蛋白质的一结构是指蛋白质多肽链中的氨基酸的排列顺序。在基因编码的蛋白质中，这种序列是由mRNA中的核苷酸序列决定的即DNA分子中核苷酸的序列决定的。 蛋白质的一结构是蛋白质最基本的结构。 其表示方法与多肽相同：从左到右，从N-末端写到C-末端，写出组成多肽链的氨基酸的三个
3、字母或单个字母的简写符号，氨基酸残基之间用“-”或 “”连接。,多肽链中氨基酸之间的连接键主要是肽键（peptide bonde），另外有的还有二硫键(disulfide bond) ，有链间和链内二硫键之分。 二硫键起着稳定空间结构的作用，二硫键越多越称稳定，而且往往与生物活性有关。,链间二硫键、链内二硫键,2 蛋白质一级结构的例子胰岛素（insulin）,胰岛素是动物胰脏中胰岛细胞分泌的一种分子量较小（5 700）的激素蛋白质； 其主要功能是促进糖原的合成和加速葡萄糖的氧化，从而使体内血糖浓度降低，即低血糖效应。,分泌不足时，组织中的糖利用发生障碍，肝糖原分解加速，并从尿中排而患糖尿病，因
4、此，临床上胰岛素可用来治疗糖尿病。 胰岛素的一级结构是由英国的Sanger(桑格)等于1953年首先完成的，花费了10年时间，这是蛋白质化学研究史上一项重大成就。,S,S,S,S,结构特点,1）胰岛素由A、B二条链组成，A链21个氨基酸残基（含4个Cys），B链30个氨基酸残基(含2个Cys) 2）有3个二硫键：A6-A11（链内）；A7-B7；A20-B19（链间） 3）没有Trp, Met，（Asp都以Asn形式存在，共有17种氨基酸）,蛋白质一级结构研究的意义,a.使人们从根本上认识由于20种氨基酸的排列顺序不同而组成不同的蛋白，并具有各种不同的生物学功能。 b.许多先天性疾病是由于某一
5、种重要的蛋白的一级结构发生改变而引起的，所以测定蛋白的一级结构有助于临床医学上对疾病的诊断。 c.因为蛋白质的一级结构中氨基酸的排列顺序是由遗传密码所决定的，氨基酸的改变最根本的原因是DNA上的核苷酸顺序发生改变所致，研究蛋白质的一级结构可以从分子水平上诊断和治疗遗传病。,核糖核酸酶的一级结构,3 蛋白质一级结构的测定（主要内容）,3.1 一级结构测定的一般步骤(或策略) 3.2 几个重要的测定步骤 3.3 蛋白质序列数据库,3.1 一级结构测定的一般步骤(或策略),1）测定蛋白质分子中多肽链的数目； 2）拆分蛋白质分子的多肽链； 3）断开多肽链内的二硫键； 4）分析测定每一多肽链的氨基酸组成
6、（amino acid composition）； 5）鉴定多肽链的N-末端和C-末端的氨基酸；,6）裂解多肽链成较小片段； 7）测定各肽段的氨基酸序列； 8）确定肽段在多肽链中的次序，即重建完整多肽链的一级结构； 9）确定多肽链中二硫键的位置。,3.2 几个重要的测定步骤（内容）,3.2.1 肽链末端的测定:N-末端;C-末端 3.2.2 肽链的拆开和分离(-S-S-的断裂) 3.2.3 氨基酸组成的分析测定 3.2.4 肽链的部分裂解:化学法, 酶法 3.2.5 肽段氨基酸序列的测定 3.2.6 肽段在多肽链中次序的确定 3.2.7 二硫键位置的确定,3.2.1 肽链末端的测定:N-末端;
7、C-末端,1） N-末端分析 二硝基氟苯（DNFB，或Sanger）法 丹磺酰氯(DNS)法 苯异硫氰酸酯(PITC,或Edman降解)法 氨肽酶（amino peptidase）法 2）C-末端分析 肼解法 还原法 羧肽酶法,二硝基氟苯（DNFB，或Sanger）法,多肽链的游离NH2与DNFB(又称为Sanger试剂)反应后，生成DNP-多肽， 酸水解生成DNP-氨基酸衍生物和其它游离氨基酸， DNP-氨基酸为黄色，然后用有机溶剂(如已酸已酯)抽提出来， 用纸层析、薄层层析或高效液相层析法(HPLC)进行定性、定量测定。,丹磺酰氯(DNS)法,该法原理与DNFB相同，只是将DNS代替DNF
8、B试剂； DNS具有强烈的荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，并且水解后的DNS-氨基酸不需要提取，可直接用纸电泳或薄层层析或荧光光度计检测。,苯异硫氰酸酯(PITC，或Edman降解)法,PITC（Edman试剂）与多肽的氨基端反应生成PTC-多肽， 在酸性有机溶剂中加热时生成PTH-氨基酸和少一个氨基酸的多肽，（PTC基只使第一个肽键的稳定性下降）， 然后用有机溶剂抽提干燥后，用薄层层析、气相色谱或HPLC等分析鉴定。 该法也可用业测定短肽的氨基酸序列，是多肽氨基酸自动测序仪的原理,氨肽酶（amino peptidase）法,氨肽酶是专门水解肽链N-末端氨基酸的一类外切酶（exopepti
9、dase）,它们能从多肽链的N-末端逐个地向里切。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放的氨基酸种类和数量，按反应时间和残基释放量作动力学曲线，就能知道该多肽链的N-末端氨基酸是什么。 此法测定有很多困难，因酶对肽键的敏感性不同，常很难判断哪个残基在前，哪个在后。 亮氨酸氨肽酶(leucine amino peptidase,LAP)是最常用的氨肽酶，其作用位点是： (N-端) Leu(或非极性aa) CONHaa(除Pro,Hyp外),肼解法,是测定C-末端最重要的化学方法， 多肽同肼（联氨）在无水条件下加热，C-末端aa被切割下来以游离形式存在，而其他的aa转变为相应的氨基酸酰肼化合物; 氨
10、基酸酰肼可与苯甲醛作用变为非水溶性化合物，从而与水溶性的C-末端氨基酸分开， C-末端氨基酸可用FDNB法或DNS法以及层析技术进行鉴定。 注意，在肼解中，Gln,Asn,Cys,等被破坏，不易测出，Arg转变为Orn,肼解反应,还原法,肽链C-末端氨基酸能被硼氢化锂还原为-氨基醇， 肽链完全水解后，代表原来C-末端氨基酸的-氨基醇，可用层析法鉴定。 Sanger早期就是采用此法鉴定胰岛素A，B链的C-末端氨基酸的。,羧肽酶（carboxypeptidase）法,羧肽酶法是最为有效、最常用的方法； 羧肽酶是一类肽链外切酶，它专一地从肽链C-末端开始逐个降解，释放出游离氨基酸。 羧肽酶A：CH（
11、R）CONHaa (除Pro, Arg,Lys外) 羧肽酶B：CH（R）CONHaa (Arg,Lys) 羧肽酶C：CH（R）CONHaa (除Hyp,二肽外) 羧肽酶Y：CH（R）CONHaa (任何氨基酸),羧肽酶（carboxypeptidase）法图示,3.2.2 肽链的拆开和分离(-S-S-的断裂),二硫键的断裂有过甲酸氧化法和巯基化合物还原法。 用过量的巯基已醇处理，同时加变性剂如8M尿素或6M盐酸胍，然后用烷基化试剂如碘已酸保护-SH，以防止重新被氧化。,还原法打开二硫键,3.2.3 氨基酸组成的分析测定,肽链的水解用酸水解，同时辅以碱水解； 6M 盐酸于110在真空或充氮的条件
12、下水解1024h,水解后去除盐酸，但Trp破坏；也可用甲基磺酸代替盐酸。 碱水解用5M氢氧化钠于110在真空或充氮的条件下水解20h左右，测出Trp。 蛋白质的氨基酸组成一般用每mol蛋白质中含氨基酸残基的mol数表示，或用每100g蛋白质中含有的氨基酸克数表示。,3.2.4 肽链的部分裂解,1）化学裂解法 溴化氰（CNBr）：MetCONHCH（R） 羟胺（NH2OH）：Asn Gly; Asn Leu; Asn Ala 2) 酶裂解法 胰蛋白酶（trypsin） 糜蛋白酶(chymotrypsin) 嗜热菌蛋白酶(thermolysin) 胃蛋白酶(pepsin),肽链的部分裂解酶法,3.
13、2.5 肽段氨基酸序列的测定,1) Edman降解法 2）酶解解法 3）质谱法 4）根据核苷酸序列的推定法,3.2.6 肽段在多肽链中次序的确定重叠肽法,例如：10个氨基酸残基的肽链用A/B两种方法的到两套肽段方法A 方法B N-末端残基A，C-末端残基S 1、AF AFGR 2、GRLY LYKW 3、KW WHS 4、HS10肽的顺序：AFGRLYKWHS,3.2.7 二硫键位置的确定对角线电泳,用胃蛋白酶水解多肽链，把水解后的混合肽段点到滤纸的中央，在pH6.5的条件下，进行第一向电泳，肽段将按其大小及电荷 的不同分离开来。 把滤低暴露在过甲酸蒸气中，使-S-S断裂，含二硫键的肽被氧化成
14、一对含磺基丙氨酸的肽。,滤纸旋转900解在与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。 肽斑用茚三酮显色确定，大多数肽段迁移率不变，并位于滤纸的一条对角线上，只有磺基丙氨酸的肽段偏离了对解线。 将每对含磺基丙氨酸的肽段取下，进行氨基酸序列分析，然后与多肽链的氨基酸序列比较，即可确定二硫键的位置。,对角线电泳图示,3.3 蛋白质序列数据库 （database or databank ）,著名的数据库： 美国国家生物医学基金会主持的PIR（Protein Information Resource,蛋白质信息库；或Protein Identification Resource,蛋白质鉴定库）,美国政府支
15、持的Gen Bank(Gene Sequence Data Bank,基因序列数据库) 欧洲的EMBL（European Molecular Biology Laboratory Data Bank,欧洲分子生物学实验室数据库）,4 蛋白质的一级结构与功能的关系,4.1同源蛋白质的物种差异与生物进化 4.2蛋白质的激活 4.3 分子病,一级结构似，蛋白质空间构象和功能也相似，例如：不同哺乳类动物的胰岛素分子。 一级结构不同，蛋白质功能不同。,4.1同源蛋白质的物种差异与生物进化,1）同源蛋白质 2）细胞色素C 3）系统树（进化树）：物种之间进化关系的图解,几个名词,同源蛋白质：在不同生物中行使
16、相同或相似功能的蛋白质, 同源蛋白质一般具有几乎相同长度的多肽链。 同源蛋白质的氨基酸序列具有明显的相似性，这种相似性称为序列同源（sequence homology）。,同源蛋白质的氨基酸序列中有许多位置的氨基酸残基对所有已研究过的物种来说都是相同的，这样的aa残基称为不变残基（invariant residue），对生物功能起决定作用； 但其他位置的氨基酸残基对不同物种有相当大的变化，这样的残基称为可变残基（variable resdue），残基的变化不影响蛋白质的功能，并且能提供物种之间亲缘关系远近的信息。,2）细胞色素C,细胞色素c是广泛存在于生物体的一类同源蛋白，一条肽链含有血红素辅
17、基。 物种间亲缘关系越近，细胞色素c的一级结构相似，其空间结构和功能也相似。 细胞色素c的作用是在生物体内传递电子。 细胞色素c的氨基酸残基有一部分在不同的生物属间有差异。,不同物种间细胞色素C序列间 氨基酸差异数目的比较,3）系统树,系统树,4.2蛋白质的激活,1）血液的凝固 2）胰岛素的形成,凝血酶原凝血酶,凝血酶作用使血纤蛋白原裂解,血液凝固的激活过程,2）胰岛素分泌：前胰岛素原胰岛素原胰岛素,3）分子病,*对于维持蛋白质功能区的特定构象，一级结构中某些氨基酸残基是必需的，如果这些氨基酸残基发生改变，蛋白质的特定构象必将被破坏，蛋白质的生物学活性丧失。*由于蛋白质分子发生变异所导致的疾病
18、称为分子病。其根本原因是基因发生变异。,如：镰刀型贫血病血红蛋白由此引起三级结构多一疏水键，四级结构发生线性缔合，导致红细胞发生溶血，不易透过毛细血管，血流速度减慢。,-链 1 2 3 4 5 6 7 正常：Hb-A Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Lys 变异：Hb-S Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Lys Hb-S 22 6 GluVal,注意,*并非一级结构中所有的氨基酸都很重要。 *有时蛋白质中某个或某几个氨基酸残基改变，并不影响蛋白质的功能。 *有些蛋白质的功能发挥仅与其某部位的特定构象有关。通常称这些特定部位为功能区。 *只要蛋白质的功能区结构完好，蛋白质的其它部位发生改变，不影响蛋白质的功能。,
