1、蛋白质一级结构的测定,魏涛,蛋白质的一级结构指：蛋白质多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置。组成一个蛋白质分子的多肽链的数目和多肽链中氨基酸的精确序列是蛋白质一级结构的两个重要方面。其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,一级结构 ( Primary Structure ),包括以下几方面内容：多肽链的数目；每条多肽链中氨基酸的种类、残 基数目和排列次序；链内或链间二硫键的位置和数目。,蛋白质一级结构测定的策略,从蛋白质开始的蛋白质序列分析 从DNA开始推蛋白质氨基酸序列 质谱法测定蛋白质的一级结构,从蛋白质开始的蛋白质序列分析,测定的基本战略 测定一级结构的准备工
2、作 测定一级结构的基本步骤,测定的基本策略,用两种裂解肽链的方法,分别得到裂解肽段；分离提纯肽段,测出各个肽段的氨基酸序列；对两套肽段序列比较,找出重叠肽,确定各肽段位置,拼凑整个肽链的氨基酸排序。,测定一级结构的准备工作,对样品纯度的要求 97%对蛋白质分子量的测定 误差10%测定分子中多肽链的数目与种类蛋白质的氨基酸组成蛋白质的配基蛋白质的端基分析,测定一级结构的基本步骤,测定蛋白质分子中多肽链的数目 拆分蛋白质分子中的多肽链 测定多肽链的氨基酸组成 分析多肽链的N末端和C末端 断裂多肽链内的二硫键 多肽链断裂成肽段 测定各个多肽段的氨基酸顺序 确定肽段在多肽链中的次序 确定原多肽链中二硫
3、键的位置,测得相对分子质量Mr很多方法可用于确定蛋白质的相对分子量，如：渗透压、扩散系数、沉降系数凝胶过滤、凝胶电泳等， 测定末端氨基酸数xX (m /Mr ) = n (蛋白质分子中肽链数目)（m为样品质量）,蛋白质中多肽链数目的确定,蛋白质中多肽链的拆分,变性：8mol/L尿素或6mol/LHCI，或高浓度盐溶液 如有二硫键交联：巯基乙醇，或过氧乙酸处理 凝胶过滤或电泳分离不同肽链,多肽链的拆分,氨基酸组成分析,酸水解： 碱水解： 甲基磺酸水解： 优点： 不破坏色氨酸， 经碱中和后可直接上机自动分析 缺点：不能有碳水化合物存在中和点不易掌握 计算出各种氨基酸分子比 多肽链分子量,确定氨基酸
4、组成,末端氨基酸分析,N末端氨基酸分析 丹黄酰氯法(DNS)：优点：可直接层析或电泳分离，荧光检测定性 定量；灵敏度高(较二硝基氟苯 法高100倍)二硝基氟苯 (DNFB or FDNB)法 ；氨肽酶法；,+ HCI,弱碱性,+ DNS-氨基酸,酸水解,游离氨基酸,有机溶剂萃取,溶于水,定量 + 定性,确定N末端氨基酸,确定肽链数目,DNS-氨基酸,将肽链裂解成小片断,要求：断裂点较少，专一性较强、产率高 酶裂解法：常用的酶：胰蛋白酶：仅断裂Lys、Arg羧基形成的肽键（但）糜蛋白酶：位点：Tyr、Phe、Trp羧基肽键胃蛋白酶：位点：两种疏水性氨基酸形成的肽键嗜热菌蛋白酶：专一性较差金黄色葡
5、萄球菌蛋白酶（Glu蛋白酶）：梭状芽孢杆菌蛋白酶（Arg蛋白酶）： 化学裂解法： 溴化氰法：专一性断裂蛋氨酸羧基形成的肽键,可得到合适大小的肽片断,Cyanogen bromide(溴化氰法）,肽段氨基酸序列的测定,Edman降解法：一次可连续测定6070个氨基酸；程序复杂，工作量大； 酶降解法： 质谱法：,Edman 降解法测定N-末端氨基酸,Edman reagent,PTC-多肽,少一个N-末端氨基酸的肽链,层析色谱鉴定,重复,与DNS法联合,肽片断在多肽链中排列次序的确定 (见p179),多肽链中二硫键位置的确定,多肽链氨基酸系列的直接测定：最初于1954年由英国剑桥大学的Sanger实验室建立；现主要由编码蛋白质的基因的核苷酸顺序推导. 蛋白质序列数据库 美国生物医学基金会的PIR (Protein Information Resource or Protein Identification Resource); 美国政府的Gen Bank (Gene Sequence Data Bank) 欧洲的EMBL (European Molecular Biology Laboratory Data Bank)（欧洲分子生物学实验室数据库） 可从“Altas of Protein Sequence and Structure”(蛋白质序列和结构图册）中查找,
