1、iTRAQ定量蛋白质组学,广州辉骏生物科技有限公司,主要内容,iTRAQ技术简介 iTRAQ试剂标记原理 iTRAQ技术优势 iTRAQ实验流程 iTRAQ实验结果示例 iTRAQ实验详细步骤,辉骏生物,iTRAQ技术简介,iTRAQ技术是由美国应用生物系统公司(Applied Biosystems Incorporation，ABI)2004年开发的同重标签标记的相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)技术。iTRAQ试剂是可与氨基（包括氨基酸N端及赖氨酸侧链氨基）连接的胺标记同重元素。在一级质谱图
2、中，任何一种iTRAQ试剂标记不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。在一级质谱中，不同来源的相同肽段表现为一个峰；在二级质谱中，iTRAQ试剂中的平衡基团发生中性丢失，信号离子表现为不同质荷比(114121)的峰，因此根据波峰的高度及面积，可以得到同一蛋白在不同样本中的表达差异；同时，肽段的MS/MS结果结合数据库检索可以鉴定出相应的蛋白种类（图1）。,辉骏生物,图1 iTRAQ技术原理图,辉骏生物,iTRAQ试剂标记原理,iTRAQ试剂包括3部分： 报告部分 肽反应部分 平衡部位(图2),报告部分共有8种：质量数分别为114121Da，因此iTRAQ最多可同时标记8组样品（客户可按需选择
3、标记个数）。肽反应部分：能与肽链N端及赖氨酸侧链发生共价连接，从而将报告部分和平衡部位标记到肽段上，几乎可以标记所有蛋白质。平衡部分：质量数分别为3124Da，与报告部分相互配合，保证iTRAQ试剂标记的不同样本的同一肽段具有相同的质荷比。,图2 ITRAQ试剂结构,辉骏生物,iTRAQ技术优势,灵敏度高：可检测出低丰度蛋白；分离能力强:可分离出酸/碱性蛋白，小于10KD或大于200KD的蛋白、难溶性蛋白等；适用范围广：可以对任何类型的蛋白质进行鉴定，包括膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白等。高通量：可同时对8个样本进行分析，特别适用于采用多种处理方式或来自多个处理时间的样本的差异蛋白分析；结果可靠：定
4、性与定量同步进行，同时给出每一个组分的相对表达水平、分子量和丰富的结构信息；自动化程度高：液质连用，自动化操作，分析速度快，分离效果好。,辉骏生物,iTRAQ实验流程,iTRAQ实验流程。1：收集不同组别的样本并分别提取蛋白质；2：蛋白质经过还原，封闭后用胰蛋白酶酶切；3：各组样本的肽段混合物分别用不同的iTRAQ试剂标记；4：等量混合各样本中的标记肽段；5：MS/MS质谱检测及分析。,辉骏生物,iTRAQ实验结果示例,1: 提取各组蛋白质、定量并用胰酶酶切；2. 各组肽段分别用4种iTRAQ试剂标记 (例如对照组用iTRAQ 117标记，其他3个实验组分别用iTRAQ 114, 115, 1
5、16标记)；3. 标记好的各组样本等量混合，液相分离和质谱分析.4: 不同样本中蛋白质的差异表达可通过二级质谱中iTRAQ试剂的峰面积确定，如图所示：与对照组相比，该蛋白在3个处理组(114-116)中的相对表达量较高。5. 根据该肽段的二级质谱峰图，结合数据库检索，得到蛋白的定性信息。,辉骏生物,iTRAQ详细实验步骤ABI试剂盒,辉骏生物,iTRAQ详细实验步骤,1：蛋白质提取可以选择提取蛋白质常用的各种溶液，裂解液里最好不要包括下面试剂，因为这些试剂会干扰iTRAQ试剂的标记反应。,辉骏生物,辉骏生物,辉骏生物,iTRAQ详细实验步骤,2：蛋白质定量(1) 可以采用Bradford方法及
6、其他方法定量初步(2) 定量取各组样本的蛋白质进行SDS-APGE电泳，银染定量，根据每个涌道染色情况微调蛋白浓度，保证后续实验中每组样本的蛋白量相同。,辉骏生物,iTRAQ详细实验步骤,3：酶切，标记 每组样本（各100g）分别加入-20预冷的丙酮（丙酮：样品体积比=6：1），颠倒混匀，-20沉淀30min4h（根据样品所需沉淀量选择时间，一般开始时可选1小时）； 12000rpm 离心15分钟，弃上清，用试剂盒中自带的溶解液dissolution buffer（20L） 和1% SDS(1L)充分混悬溶解样品； 加入还原试剂2L，混匀，60 反应1h； 加入半胱氨酸封闭试剂（cystine
7、 blocking regent）1L,室温处理10分钟； 按照酶：蛋白质=1：20的比例加入trypsin酶,37酶解过夜（16h）； 113,114,115,116,117,118,119,121各管标记试剂中加入50L异丙醇(试剂盒中自带），混匀，分别加入各管样品中，室温反应1h，之后各加入3倍体积的水，使标记试剂分解。标记和样品对应关系如下:4R117,未知118，BOO6119,11R121； 合并各管标记好的样品，真空冷冻干燥。,辉骏生物,iTRAQ详细实验步骤,4： 除盐，此步操作是将标记过程中的标记试剂和相关buffer的盐除去，以便于后续分析。（1）100%乙腈冲洗柱子3次（
8、2）0.1%TFA(水溶),冲洗柱子三次（3）用400uL 0.1%TFA溶解样品，加载到柱子上（4）0.1%TFA 冲洗柱子35次（5）用50%乙腈 0.1%TFA 400L洗脱下样品（6）将样品冷冻干燥后进行后续分析。,辉骏生物,iTRAQ详细实验步骤,5: 第一维强阳离子柱(SCX)分离 （1）仪器及试剂：色谱仪20AD(岛津)真空离心浓缩机(Christ RVC 2-25，Christ，Germany) 磷酸二氢钾(国药集团) 氯化钾(国药集团) 乙腈ACN(Fisher) （2）具体操作参数柱子信息：Polysulfoethyl column,2.1mm*100mm,5u,200A,
9、 The Nest Group,Inc.MAA相：10mM KH2PO4，25% CAN，PH 2.6B相：10mM KH2PO4，350mM KCl，25%ACN，PH 2.6紫外检测波长：214nm/280nm流速：200L/min梯度：60min,辉骏生物,B%从5分钟5%到40分钟上升至25%Time(min) B%0 05 540 2545 8050 8051 060 stop根据峰型和时间共收取20个梯度,真空离心浓缩后，用50L RPLC A相5%ACN,0.1%甲酸(TEDIA,Fairfield,USA)溶解，进行第二维分析。,辉骏生物,iTRAQ详细实验步骤,6: 第二维反
10、相液质联用RPLC-MS （1）仪器及试剂色谱仪20AD(岛津)质谱仪 QSTAR XL（Applied Biosystem,USA）乙腈ACN(Fisher)甲酸（TEDIA）（2）具体操作参数反相柱信息：ZORBAX 300SB-C18 column(5 m, 300A, 0.1 x 150mm ，microm ,USA)色谱分离90min，梯度B%从5分钟5%到70分钟上升至35%。A相：5%ACN,0.1%甲酸B相：95%ACN,0.1%甲酸流速： 300nL/min,辉骏生物,Time(min) B%5 5%90 35%95 80%100 80%105 5%120 stop质谱鉴定：MS扫描范围400-1800MS/MS扫描范围100-2000IDA 采集模式一个图谱选择四个最强的母离子进行串级扫描。,辉骏生物,iTRAQ详细实验步骤,7: 数据检索 (1)蛋白质检索检索软件：Protein Pilot 3.0 (ABI ,USA) (2)蛋白质功能检索数据库：www.uniprot.org先将检索得到的蛋白质的Gi号map成uniprot数据库里相应的登录号（uniprotDB AC），然后检索蛋白质的相关信息，并将GO（Gene ontology）一项提取整理成excel表格。,辉骏生物,THANKS!, 广州辉骏生物科技有限公司,
